Bilgisayarlı tomografi (BT) ile tanımlanan pulmoner nodüllerin ayırıcı tanısı klinik uygulamada halen bir sorun olmaya devam etmektedir.Burada sağlıklı kontroller, iyi huylu akciğer nodülleri ve evre I akciğer adenokarsinomu dahil olmak üzere 480 serum örneğinin global metabolomunu karakterize ediyoruz.Adenokarsinomlar benzersiz metabolomik profiller sergilerken iyi huylu nodüller ve sağlıklı bireyler metabolomik profillerde yüksek benzerlik gösterir.Keşif grubunda (n = 306), iyi huylu ve kötü huylu nodülleri ayırt etmek için 27 metabolitten oluşan bir set tanımlandı.İç doğrulama (n = 104) ve dış doğrulama (n = 111) gruplarındaki diskriminant modelinin AUC'si sırasıyla 0,915 ve 0,945 idi.Yol analizi, iyi huylu nodüller ve sağlıklı kontrollerle karşılaştırıldığında akciğer adenokarsinomu serumunda triptofanın azalmasıyla ilişkili glikolitik metabolitlerin arttığını ortaya çıkardı ve triptofan alımının akciğer kanseri hücrelerinde glikolizi desteklediğini öne sürdü.Çalışmamız, BT ile tespit edilen pulmoner nodül riskinin değerlendirilmesinde serum metabolit biyobelirteçlerinin değerini vurgulamaktadır.
Erken tanı, kanser hastalarının hayatta kalma oranlarını artırmak için kritik öneme sahiptir.ABD Ulusal Akciğer Kanseri Tarama Çalışması (NLST) ve Avrupa NELSON Çalışmasından elde edilen sonuçlar, düşük doz bilgisayarlı tomografi (LDCT) ile taramanın, yüksek risk gruplarındaki akciğer kanseri mortalitesini önemli ölçüde azaltabildiğini göstermiştir1,2,3.Akciğer kanseri taraması için LDCT'nin yaygın olarak kullanılmasından bu yana, asemptomatik pulmoner nodüllerin rastlantısal radyografik bulgularının görülme sıklığı artmaya devam etmiştir 4 .Pulmoner nodüller, çapı 3 cm'ye kadar olan fokal opasiteler olarak tanımlanır5.Malignite olasılığını değerlendirmede ve LDCT'de tesadüfen tespit edilen çok sayıda pulmoner nodülle baş etmede zorluklarla karşılaşıyoruz.BT'nin sınırlamaları, sık takip muayenelerine ve yanlış pozitif sonuçlara yol açarak gereksiz müdahaleye ve aşırı tedaviye yol açabilir6.Bu nedenle, akciğer kanserini erken evrelerde doğru bir şekilde tanımlamak ve iyi huylu nodüllerin çoğunu ilk tespitte ayırt etmek için güvenilir ve kullanışlı biyobelirteçlerin geliştirilmesine ihtiyaç vardır 7 .
Genomik, proteomik veya DNA metilasyonu8,9,10 dahil olmak üzere kanın (serum, plazma, periferik kan mononükleer hücreleri) kapsamlı moleküler analizi, akciğer kanseri için tanısal biyobelirteçlerin keşfine olan ilginin artmasına yol açmıştır.Bu arada metabolomik yaklaşımlar, endojen ve eksojen eylemlerden etkilenen hücresel son ürünleri ölçer ve bu nedenle hastalığın başlangıcını ve sonucunu tahmin etmek için uygulanır.Sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometresi (LC-MS), farklı fizikokimyasal özelliklere sahip metabolitleri kapsayabilen yüksek hassasiyeti ve geniş dinamik aralığı nedeniyle metabolomik çalışmalarda yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir11,12,13.Her ne kadar akciğer kanseri teşhisi14,15,16,17 ve tedavi etkinliği18 ile ilişkili biyobelirteçleri tanımlamak için plazma/serumun global metabolomik analizi kullanılmış olsa da, iyi huylu ve kötü huylu akciğer nodüllerini ayırt etmek için serum metabolit sınıflandırıcıları üzerinde daha fazla çalışılması gerekmektedir.-büyük araştırma.
Adenokarsinom ve skuamöz hücreli karsinom, küçük hücreli dışı akciğer kanserinin (KHDAK) iki ana alt tipidir.Çeşitli BT tarama testleri, adenokarsinomun en sık görülen histolojik akciğer kanseri türü olduğunu göstermektedir1,19,20,21.Bu çalışmada, sağlıklı kontroller, iyi huylu pulmoner nodüller ve BT ile saptanan ≤3 cm dahil olmak üzere toplam 695 serum örneğinde metabolomik analiz gerçekleştirmek için ultra performanslı sıvı kromatografisi-yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi (UPLC-HRMS) kullandık.Aşama I akciğer adenokarsinomu taraması.Akciğer adenokarsinomunu iyi huylu nodüllerden ve sağlıklı kontrollerden ayıran bir serum metabolitleri paneli belirledik.Yol zenginleştirme analizi, anormal triptofan ve glikoz metabolizmasının, iyi huylu nodüller ve sağlıklı kontrollerle karşılaştırıldığında akciğer adenokarsinomunda yaygın değişiklikler olduğunu ortaya çıkardı.Son olarak, erken ayırıcı tanı ve risk değerlendirmesine yardımcı olabilecek, LDCT tarafından tespit edilen malign ve benign pulmoner nodülleri ayırt etmek için yüksek özgüllük ve duyarlılığa sahip bir serum metabolik sınıflandırıcısı oluşturduk ve doğruladık.
Bu çalışmada 174 sağlıklı kontrolden, 292 benign pulmoner nodüllü hastadan ve 229 evre I akciğer adenokarsinomlu hastadan cinsiyet ve yaş uyumlu serum örnekleri retrospektif olarak toplandı.695 deneğin demografik özellikleri Ek Tablo 1'de gösterilmektedir.
Şekil 1a'da gösterildiği gibi, Sun Yat-sen Üniversitesi Kanser Merkezi'nde 174 sağlıklı kontrol (HC), 170 iyi huylu nodül (BN) ve 136 evre I akciğer adenokarsinomu (LA) örneği dahil olmak üzere toplam 480 serum örneği toplandı.Ultra performanslı sıvı kromatografisi-yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi (UPLC-HRMS) kullanılarak hedeflenmemiş metabolomik profil oluşturmaya yönelik keşif grubu.Ek Şekil 1'de gösterildiği gibi, bir sınıflandırma modeli oluşturmak ve diferansiyel yol analizini daha fazla araştırmak için LA ile HC, LA ve BN arasındaki diferansiyel metabolitler tanımlandı.Sun Yat-sen Üniversitesi Kanser Merkezi tarafından toplanan 104 örnek ve diğer iki hastane tarafından toplanan 111 örnek sırasıyla iç ve dış doğrulamaya tabi tutuldu.
Ultra performanslı sıvı kromatografisi-yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi (UPLC-HRMS) kullanılarak küresel serum metabolomik analizi yapılan keşif kohortunda bir çalışma popülasyonu.b Sağlıklı kontroller (HC, n = 174), iyi huylu nodüller (BN, n = 170) ve evre I akciğer adenokarsinomu dahil olmak üzere, çalışma grubundan alınan 480 serum örneğinin toplam metabolomunun kısmi en küçük kareler diskriminant analizi (PLS-DA) (Los Angeles, sayı = 136).+ESI, pozitif elektrosprey iyonizasyon modu, -ESI, negatif elektrosprey iyonizasyon modu.c – e Verilen iki grupta önemli ölçüde farklı bolluğa sahip metabolitler (iki kuyruklu Wilcoxon işaretli sıralama testi, yanlış keşif oranı ayarlanmış p değeri, FDR <0,05) kırmızı (kat değişimi > 1,2) ve mavi (kat değişimi <0,83) ile gösterilmiştir. .) yanardağ grafiğinde gösterilmiştir.f LA ve BN arasındaki açıklamalı metabolitlerin sayısındaki önemli farklılıkları gösteren hiyerarşik kümelenme ısı haritası.Kaynak verileri, kaynak veri dosyaları biçiminde sağlanır.
Keşif grubundaki 174 HC, 170 BN ve 136 LA'nın toplam serum metabolomu, UPLC-HRMS analizi kullanılarak analiz edildi.Öncelikle kalite kontrol (QC) örneklerinin denetimsiz bir temel bileşen analizi (PCA) modelinin merkezinde sıkı bir şekilde kümelendiğini ve mevcut çalışmanın performansının istikrarını doğruladığını gösterdik (Ek Şekil 2).
Şekil 1b'deki kısmi en küçük kareler ayırma analizinde (PLS-DA) gösterildiği gibi, pozitif (+ESI) ve negatif (−ESI) elektrosprey iyonizasyon modlarında LA ile BN, LA ve HC arasında açık farklar olduğunu bulduk. .yalıtılmış.Ancak +ESI ve -ESI koşullarında BN ve HC arasında anlamlı bir fark bulunamadı.
LA ve HC arasında 382 farklı özellik, LA ve BN arasında 231 farklı özellik ve BN ile HC arasında 95 farklı özellik bulduk (Wilcoxon işaretli sıra testi, FDR <0,05 ve çoklu değişiklik >1,2 veya <0,83) (Şekil .1c-e) )..Zirveler ayrıca bir veritabanına (mzCloud/HMDB/Chemspider kütüphanesi) karşı m/z değeri, tutma süresi ve parçalanma kütle spektrumu araması (ayrıntılar Yöntemler bölümünde açıklanmıştır) 22 ile açıklanmıştır (Ek Veri 3).Son olarak, sırasıyla LA'ya karşı BN (Şekil 1f ve Ek Tablo 2) ve LA'ya karşı HC (Ek Şekil 3 ve Ek Tablo 2) için bol miktarda önemli farklılıklara sahip 33 ve 38 açıklamalı metabolit tanımlandı.Buna karşılık, PLS-DA'da BN ve HC arasındaki örtüşme ile tutarlı olarak, BN ve HC'de (Ek Tablo 2) bol miktarda önemli farklılıklara sahip yalnızca 3 metabolit tanımlandı.Bu diferansiyel metabolitler çok çeşitli biyokimyasalları kapsar (Ek Şekil 4).Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar, iyi huylu akciğer nodülleri veya sağlıklı kişilerle karşılaştırıldığında, erken evre akciğer kanserinin malign dönüşümünü yansıtan serum metabolomunda önemli değişiklikler olduğunu göstermektedir.Bu arada, BN ve HC'nin serum metabolomunun benzerliği, benign pulmoner nodüllerin sağlıklı bireylerle birçok biyolojik özelliği paylaşabileceğini düşündürmektedir.Akciğer adenokarsinomu alt tipi 23'te epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) gen mutasyonlarının yaygın olduğu göz önüne alındığında, sürücü mutasyonların serum metabolomu üzerindeki etkisini belirlemeye çalıştık.Daha sonra akciğer adenokarsinomu grubunda EGFR durumu olan 72 olgunun genel metabolomik profilini analiz ettik.İlginç bir şekilde, PCA analizinde EGFR mutant hastaları (n = 41) ve EGFR vahşi tip hastaları (n = 31) arasında karşılaştırılabilir profiller bulduk (Ek Şekil 5a).Bununla birlikte, EGFR mutasyonlu hastalarda vahşi tip EGFR'li hastalara kıyasla bolluğu önemli ölçüde değişen 7 metabolit belirledik (t testi, p <0.05 ve kat değişikliği> 1.2 veya <0.83) (Ek Şekil 5b).Bu metabolitlerin çoğunluğu (7'den 5'i) yağ asidi oksidasyon yollarında önemli bir rol oynayan asilkarnitinlerdir.
Şekil 2a'da gösterilen iş akışında gösterildiği gibi, nodül sınıflandırmasına yönelik biyobelirteçler, en az mutlak büzülme operatörleri ve LA (n = 136) ve BN'de (n = 170) tanımlanan 33 diferansiyel metabolite dayalı seçim kullanılarak elde edildi.Değişkenlerin en iyi kombinasyonu (LASSO) – ikili lojistik regresyon modeli.Modelin güvenilirliğini test etmek için on kat çapraz doğrulama kullanıldı.Değişken seçimi ve parametre düzenlemesi, λ24 parametresi ile olasılık maksimizasyon cezası ile ayarlanır.Diskriminant modelinin sınıflandırma performansını test etmek için dahili doğrulama (n = 104) ve harici doğrulama (n = 111) gruplarında bağımsız olarak global metabolomik analiz daha da gerçekleştirildi.Sonuç olarak, keşif setindeki 27 metabolit, en büyük ortalama AUC değerine sahip en iyi ayırt edici model olarak tanımlandı (Şekil 2b), bunların arasında 9'u BN'ye kıyasla LA'da artan aktiviteye ve 18'i azalmış aktiviteye sahipti (Şekil 2c).
On kat çapraz doğrulama aracılığıyla ikili lojistik regresyon modeli kullanılarak keşif setindeki en iyi serum metabolitleri panelinin seçilmesi ve dahili ve harici doğrulama setlerinde tahmin performansının değerlendirilmesi de dahil olmak üzere pulmoner nodül sınıflandırıcı oluşturmaya yönelik iş akışı.b Metabolik biyobelirteç seçimi için LASSO regresyon modelinin çapraz doğrulama istatistikleri.Yukarıda verilen sayılar, belirli bir λ'da seçilen biyobelirteçlerin ortalama sayısını temsil eder.Kırmızı noktalı çizgi, karşılık gelen lambdadaki ortalama AUC değerini temsil eder.Gri hata çubukları minimum ve maksimum AUC değerlerini temsil eder.Noktalı çizgi, seçilen 27 biyobelirteçle en iyi modeli gösterir.AUC, alıcı çalışma karakteristiği (ROC) eğrisinin altındaki alan.c Keşif grubundaki BN grubuyla karşılaştırıldığında LA grubunda seçilen 27 metabolitin kat değişiklikleri.Kırmızı sütun – etkinleştirme.Mavi sütun bir düşüştür.d–f Keşif, dahili ve harici doğrulama setlerindeki 27 metabolit kombinasyonuna dayanan diskriminant modelinin gücünü gösteren alıcı işletim karakteristiği (ROC) eğrileri.Kaynak verileri, kaynak veri dosyaları biçiminde sağlanır.
Bu 27 metabolitin ağırlıklı regresyon katsayılarına dayanarak bir tahmin modeli oluşturuldu (Ek Tablo 3).Bu 27 metabolite dayalı ROC analizi, eğri altında alan (AUC) değeri 0,933, keşif grubu duyarlılığı 0,868 ve özgüllük 0,859 oldu (Şekil 2d).Bu arada, LA ve HC arasındaki açıklamalı 38 diferansiyel metabolit arasında, 16 metabolitten oluşan bir grup, LA'yı HC'den ayırmada 0.801 duyarlılık ve 0.856 özgüllük ile 0.902'lik bir AUC'ye ulaştı (Ek Şekil 6a-c).Diferansiyel metabolitler için farklı kat değişim eşiklerine dayalı AUC değerleri de karşılaştırıldı.Kat değişim seviyesi 1,2'ye karşı 1,5 veya 2,0'a ayarlandığında sınıflandırma modelinin LA ve BN (HC) arasında ayrım yapmada en iyi performansı gösterdiğini bulduk (Ek Şekil 7a,b).27 metabolit grubuna dayanan sınıflandırma modeli, iç ve dış kohortlarda daha da doğrulandı.AUC, dahili doğrulama için 0,915 (duyarlılık 0,867, özgüllük 0,811) ve harici doğrulama için 0,945 (duyarlılık 0,810, özgüllük 0,979) idi (Şekil 2e, f).Laboratuvarlar arası verimliliği değerlendirmek için, harici gruptan alınan 40 örnek, Yöntemler bölümünde açıklandığı gibi harici bir laboratuvarda analiz edildi.Sınıflandırma doğruluğu 0,925'lik bir AUC'ye ulaştı (Ek Şekil 8).Akciğer skuamöz hücreli karsinomu (LUSC), küçük hücreli dışı akciğer kanserinin (NSCLC) akciğer adenokarsinomundan (LUAD) sonra en yaygın ikinci alt tipi olduğundan, metabolik profillerin doğrulanmış potansiyel faydasını da test ettik.BN ve 16 LUSC vakası.LUSC ve BN arasındaki ayrımcılığın AUC'si 0,776 idi (Ek Şekil 9), bu da LUAD ve BN arasındaki ayrımcılığa kıyasla daha zayıf yetenek olduğunu gösteriyor.
Çalışmalar, BT görüntülerindeki nodüllerin boyutunun malignite olasılığı ile pozitif ilişkili olduğunu ve nodül tedavisinin önemli bir belirleyicisi olmaya devam ettiğini göstermiştir25,26,27.NELSON tarama çalışmasının geniş grubundan elde edilen verilerin analizi, düğümleri <5 mm olan deneklerde malignite riskinin, düğümleri olmayan deneklerle bile benzer olduğunu gösterdi28.Bu nedenle, düzenli BT takibi gerektiren minimum boyut, İngiliz Toraks Derneği (BTS) tarafından önerildiği üzere 5 mm ve Fleischner Topluluğu29 tarafından önerildiği gibi 6 mm'dir.Bununla birlikte, 6 mm'den büyük ve belirgin iyi huylu özellikleri olmayan, belirsiz pulmoner nodüller (IPN) olarak adlandırılan nodüller, klinik uygulamada değerlendirme ve yönetimde büyük bir zorluk olmaya devam etmektedir30,31.Daha sonra, keşif ve dahili doğrulama gruplarından toplanan örnekleri kullanarak nodül boyutunun metabolomik imzaları etkileyip etkilemediğini inceledik.Doğrulanmış 27 biyobelirtece odaklanarak ilk olarak HC ve BN 6 mm'nin altındaki metabolomların PCA profillerini karşılaştırdık.HC ve BN için veri noktalarının çoğunun örtüştüğünü bulduk, bu da serum metabolit seviyelerinin her iki grupta da benzer olduğunu gösterdi (Şekil 3a).Farklı boyut aralıklarındaki özellik haritaları BN ve LA'da korunmaya devam etti (Şekil 3b, c), oysa 6-20 mm aralığında malign ve benign nodüller arasında bir ayrım gözlendi (Şekil 3d).Bu kohortun 6 ila 20 mm arası nodüllerin malignitesini öngörmede AUC'si 0,927, özgüllüğü 0,868 ve duyarlılığı 0,820 idi (Şekil 3e, f).Sonuçlarımız, sınıflandırıcının, nodül boyutundan bağımsız olarak erken malign dönüşümün neden olduğu metabolik değişiklikleri yakalayabildiğini göstermektedir.
ad 27 metabolitten oluşan metabolik sınıflandırıcıya dayalı olarak belirtilen gruplar arasındaki PCA profillerinin karşılaştırılması.CC ve BN < 6 mm.b BN < 6 mm vs BN 6–20 mm.LA'da 6–20 mm'ye karşı LA 20–30 mm.g BN 6–20 mm ve LA 6–20 mm.GC, n = 174;BN < 6 mm, n = 153;BN 6–20 mm, n = 91;LA 6–20 mm, n = 89;LA 20–30 mm, n = 77. e 6–20 mm nodüller için ayırt edici model performansını gösteren alıcı çalışma karakteristiği (ROC) eğrisi.f Olasılık değerleri 6–20 mm ölçülerindeki nodüller için lojistik regresyon modeline göre hesaplanmıştır.Gri noktalı çizgi, optimum kesme değerini (0,455) temsil eder.Yukarıdaki sayılar Los Angeles için öngörülen vakaların yüzdesini temsil etmektedir.İki kuyruklu Öğrenci t testi kullanın.PCA, temel bileşen analizi.Eğrinin altındaki AUC alanı.Kaynak verileri, kaynak veri dosyaları biçiminde sağlanır.
Önerilen malignite tahmin modelinin performansını göstermek için benzer pulmoner nodül boyutlarına (7-9 mm) sahip dört örnek (44-61 yaş arası) seçildi (Şekil 4a, b).İlk taramada, Vaka 1, iyi huylulukla ilişkili bir özellik olan kalsifikasyonlu katı bir nodül olarak sunulurken, Vaka 2, belirgin iyi huylu özellikleri olmayan belirsiz, kısmen katı bir nodül olarak sunuldu.Üç tur takip BT taraması, bu vakaların 4 yıllık bir süre boyunca stabil kaldığını ve bu nedenle iyi huylu nodüller olarak kabul edildiğini gösterdi (Şekil 4a).Seri CT taramalarının klinik değerlendirmesiyle karşılaştırıldığında, mevcut sınıflandırıcı modeliyle tek atışlı serum metabolit analizi, bu iyi huylu nodülleri olasılıksal kısıtlamalara dayanarak hızlı ve doğru bir şekilde tanımladı (Tablo 1).Şekil 4b, vaka 3'te, çoğunlukla maligniteyle ilişkili olan, plevral retraksiyon belirtileri gösteren bir nodülü göstermektedir32.Olgu 4, benign bir nedene dair kanıt bulunmayan, belirsiz, kısmen katı bir nodül olarak sunuldu.Tüm bu vakaların sınıflandırıcı modeline göre malign olduğu tahmin edildi (Tablo 1).Akciğer adenokarsinomunun değerlendirmesi, akciğer rezeksiyonu ameliyatı sonrası histopatolojik inceleme ile gösterilmiştir (Şekil 4b).Harici doğrulama seti için metabolik sınıflandırıcı, 6 mm'den büyük iki belirsiz akciğer nodülü vakasını doğru bir şekilde tahmin etti (Ek Şekil 10).
İki iyi huylu nodül olgusunun akciğerlerinin eksenel penceresinin BT görüntüleri.Durum 1'de, 4 yıl sonraki BT taramasında sağ alt lobda kalsifikasyonla birlikte 7 mm boyutunda stabil bir katı nodül görüldü.Durum 2'de 5 yıl sonra yapılan BT taramasında sağ üst lobda 7 mm çapında stabil, kısmen katı bir nodül ortaya çıktı.b Akciğerlerin eksenel pencere BT görüntüleri ve akciğer rezeksiyonu öncesinde iki evre I adenokarsinom vakasının ilgili patolojik çalışmaları.Olgu 3'te sağ üst lobda plevral retraksiyonla birlikte 8 mm çapında nodül görüldü.Vaka 4'te sol üst lobda 9 mm boyutlarında kısmen katı buzlu cam nodülü ortaya çıktı.Akciğer adenokarsinomunun asiner büyüme modelini gösteren, rezeke edilen akciğer dokusunun hematoksilen ve eozin (H&E) boyaması (ölçek çubuğu = 50 μm).Oklar BT görüntülerinde tespit edilen nodülleri gösterir.H&E görüntüleri patolog tarafından incelenen birden fazla (>3) mikroskobik alanın temsili görüntüleridir.
Birlikte ele alındığında sonuçlarımız, BT taramasını değerlendirirken zorluklar yaratabilecek pulmoner nodüllerin ayırıcı tanısında serum metabolit biyobelirteçlerinin potansiyel değerini göstermektedir.
Doğrulanmış bir diferansiyel metabolit paneline dayanarak, önemli metabolik değişikliklerin biyolojik bağıntılarını belirlemeye çalıştık.MetaboAnalyst tarafından yapılan KEGG yolu zenginleştirme analizi, verilen iki grup arasında önemli ölçüde değiştirilmiş 6 ortak yol tanımladı (LA'ya karşı HC ve LA'ya karşı BN, düzeltilmiş p ≤ 0,001, etki > 0,01).Bu değişiklikler piruvat metabolizması, triptofan metabolizması, niasin ve nikotinamid metabolizması, glikoliz, TCA döngüsü ve pürin metabolizmasındaki bozukluklarla karakterize edildi (Şekil 5a).Daha sonra mutlak ölçüm kullanarak büyük değişiklikleri doğrulamak için hedeflenen metabolomikler gerçekleştirdik.Otantik metabolit standartları kullanılarak üçlü dört kutuplu kütle spektrometresi (QQQ) ile yaygın olarak değiştirilmiş yollardaki ortak metabolitlerin belirlenmesi.Metabolomik çalışma hedef örneğinin demografik özellikleri Ek Tablo 4'e dahil edilmiştir. Küresel metabolomik sonuçlarımızla tutarlı olarak, kantitatif analiz, hipoksantin ve ksantin, piruvat ve laktatın LA'da BN ve HC'ye kıyasla arttığını doğruladı (Şekil 5b, c, p<0.05).Ancak BN ve HC arasında bu metabolitlerde anlamlı bir fark bulunamadı.
BN ve HC gruplarına kıyasla LA grubunda önemli ölçüde farklı metabolitlerin KEGG yolu zenginleştirme analizi.İki kuyruklu bir Globaltest kullanıldı ve p değerleri Holm-Bonferroni yöntemi kullanılarak ayarlandı (ayarlanmış p ≤ 0,001 ve etki büyüklüğü > 0,01).b – d Keman grafikleri, LC-MS/MS ile belirlenen serum HC, BN ve LA'daki hipoksantin, ksantin, laktat, piruvat ve triptofan seviyelerini gösterir (grup başına n = 70).Beyaz ve siyah noktalı çizgiler sırasıyla medyan ve çeyreği gösterir.e LUAD-TCGA veri setindeki normal akciğer dokusuna (n = 59) kıyasla akciğer adenokarsinomunda (n = 513) SLC7A5 ve QPRT'nin normalleştirilmiş Log2TPM (milyon başına transkript) mRNA ekspresyonunu gösteren keman grafiği.Beyaz kutu çeyrekler arası aralığı, ortadaki yatay siyah çizgi medyanı ve kutudan uzanan dikey siyah çizgi %95 güven aralığını (CI) temsil eder.f TCGA veri setinde akciğer adenokarsinomunda (n = 513) ve normal akciğer dokusunda (n = 59) SLC7A5 ve GAPDH ekspresyonunun Pearson korelasyon grafiği.Gri alan %95 GA'yı temsil eder.r, Pearson korelasyon katsayısı.g Spesifik olmayan shRNA kontrolü (NC) ve LC-MS/MS ile belirlenen shSLC7A5 (Sh1, Sh2) ile transfekte edilmiş A549 hücrelerinde normalleştirilmiş hücresel triptofan seviyeleri.Her gruptaki biyolojik olarak bağımsız beş numunenin istatistiksel analizi sunulmaktadır.h A549 hücrelerinde (NC) ve SLC7A5'in yıkılan A549 hücrelerinde (Sh1, Sh2) hücresel NADt seviyeleri (NAD+ ve NADH dahil olmak üzere toplam NAD).Her gruptaki biyolojik olarak bağımsız üç numunenin istatistiksel analizi sunulmaktadır.i A549 hücrelerinin SLC7A5 yıkımından önce ve sonra glikolitik aktivitesi, hücre dışı asitleşme oranı (ECAR) (n = grup başına biyolojik olarak bağımsız 4 örnek) ile ölçüldü.2-DG,2-deoksi-D-glikoz.(b-h)'de iki kuyruklu Öğrenci t testi kullanıldı.(g – i) 'de hata çubukları ortalama ± SD'yi temsil eder, her deney bağımsız olarak üç kez gerçekleştirildi ve sonuçlar benzerdi.Kaynak verileri, kaynak veri dosyaları biçiminde sağlanır.
LA grubunda değişen triptofan metabolizmasının önemli etkisi göz önüne alındığında, HC, BN ve LA gruplarındaki serum triptofan seviyelerini de QQQ kullanarak değerlendirdik.HC veya BN ile karşılaştırıldığında LA'da serum triptofanın azaldığını bulduk (p < 0,001, Şekil 5d), bu da akciğer kanserli hastalarda dolaşımdaki triptofan düzeylerinin kontrol grubundaki sağlıklı kontrollere göre daha düşük olduğuna dair önceki bulgularla tutarlıdır33,34 ,35.PET/CT izleyicisi 11C-metil-L-triptofanın kullanıldığı başka bir çalışma, akciğer kanseri dokusunda triptofan sinyali tutma süresinin, iyi huylu lezyonlara veya normal dokuya kıyasla önemli ölçüde arttığını buldu36.LA serumundaki triptofandaki azalmanın, akciğer kanseri hücreleri tarafından aktif triptofan alımını yansıtabileceğini varsayıyoruz.
Triptofan katabolizmasının kinurenin yolunun son ürününün, glikolizde gliseraldehit-3-fosfatın 1,3-bifosfogliserat ile reaksiyonu için önemli bir substrat olan NAD+37,38 olduğu da bilinmektedir39.Önceki çalışmalar, bağışıklık düzenlemesinde triptofan katabolizmasının rolüne odaklanmışken, bu çalışmada gözlemlenen triptofan düzensizliği ile glikolitik yollar arasındaki etkileşimi açıklamaya çalıştık.Çözünen madde taşıyıcı ailesi 7 üye 5'in (SLC7A5) bir triptofan taşıyıcısı olduğu bilinmektedir43,44,45.Kinolinik asit fosforibosiltransferaz (QPRT), kinolinik asidi NAMN46'ya dönüştüren kinurenin yolunun aşağısında bulunan bir enzimdir.LUAD TCGA veri setinin incelenmesi, hem SLC7A5 hem de QPRT'nin tümör dokusunda normal dokuya kıyasla önemli ölçüde yukarı doğru düzenlendiğini ortaya çıkardı (Şekil 5e).Bu artış, akciğer adenokarsinomunun evre I ve II'nin yanı sıra evre III ve IV'te de gözlendi (Ek Şekil 11), bu, tümör oluşumu ile ilişkili triptofan metabolizmasındaki erken bozuklukları gösterir.
Ek olarak LUAD-TCGA veri seti, kanser hastası numunelerinde SLC7A5 ile GAPDH mRNA ekspresyonu arasında pozitif bir korelasyon gösterdi (r = 0,45, p = 1,55E-26, Şekil 5f).Buna karşılık normal akciğer dokusundaki bu tür gen imzaları arasında anlamlı bir korelasyon bulunamadı (r = 0,25, p = 0,06, Şekil 5f).A549 hücrelerinde SLC7A5'in (Ek Şekil 12) yıkılması, hücresel triptofan ve NAD(H) seviyelerini (Şekil 5g, h) önemli ölçüde azalttı, bu da hücre dışı asitlenme oranı (ECAR) (Şekil 1) ile ölçülen zayıflatılmış glikolitik aktiviteye neden oldu.5i).Dolayısıyla, serumdaki ve in vitro tespitteki metabolik değişikliklere dayanarak, triptofan metabolizmasının kinurenin yolu yoluyla NAD+ üretebileceğini ve akciğer kanserinde glikolizi teşvik etmede önemli bir rol oynayabileceğini varsayıyoruz.
Çalışmalar, LDCT ile tespit edilen çok sayıda belirsiz pulmoner nodülün, yanlış pozitif malignite tanısı nedeniyle PET-CT, akciğer biyopsisi gibi ek testlere ve aşırı tedaviye ihtiyaç duyulmasına yol açabileceğini göstermiştir.31 Şekil 6'da gösterildiği gibi, çalışmamız, BT ile tespit edilen pulmoner nodüllerin risk sınıflandırmasını ve ardından yönetimini geliştirebilecek potansiyel tanı değeri olan bir serum metabolitleri paneli tanımladı.
Pulmoner nodüller, iyi huylu veya kötü huylu nedenleri düşündüren görüntüleme özelliklerine sahip düşük doz bilgisayarlı tomografi (LDCT) kullanılarak değerlendirilir.Nodüllerin sonucunun belirsiz olması, sık kontrollere, gereksiz müdahalelere ve aşırı tedaviye yol açabilir.Tanı değeri olan serum metabolik sınıflandırıcılarının dahil edilmesi, risk değerlendirmesini ve pulmoner nodüllerin müteakip yönetimini iyileştirebilir.PET pozitron emisyon tomografisi.
ABD NLST çalışması ve Avrupa NELSON çalışmasından elde edilen veriler, yüksek riskli grupların düşük doz bilgisayarlı tomografi (LDCT) ile taranmasının akciğer kanseri mortalitesini azaltabileceğini göstermektedir1,3.Bununla birlikte, LDCT ile tespit edilen çok sayıda rastlantısal pulmoner nodülün risk değerlendirmesi ve ardından klinik yönetimi en zorlu konu olmaya devam etmektedir.Ana amaç, güvenilir biyobelirteçleri dahil ederek mevcut LDCT tabanlı protokollerin doğru sınıflandırmasını optimize etmektir.
Kan metabolitleri gibi belirli moleküler biyobelirteçler, akciğer kanserini sağlıklı kontrollerle karşılaştırarak tanımlanmıştır15,17.Bu çalışmada, LDCT ile tesadüfen tespit edilen benign ve malign pulmoner nodülleri ayırt etmek için serum metabolomik analizinin uygulanmasına odaklandık.UPLC-HRMS analizini kullanarak sağlıklı kontrol (HC), iyi huylu akciğer nodülleri (BN) ve evre I akciğer adenokarsinomu (LA) numunelerinin global serum metabolomunu karşılaştırdık.HC ve BN'nin benzer metabolik profillere sahip olduğunu, LA'nın ise HC ve BN'ye kıyasla önemli değişiklikler gösterdiğini bulduk.LA'yı HC ve BN'den ayıran iki grup serum metaboliti belirledik.
İyi huylu ve kötü huylu nodüllere yönelik mevcut LDCT tabanlı tanımlama şeması temel olarak nodüllerin zaman içindeki boyutuna, yoğunluğuna, morfolojisine ve büyüme hızına dayanmaktadır30.Önceki çalışmalar nodüllerin boyutunun akciğer kanseri olasılığıyla yakından ilişkili olduğunu göstermişti.Yüksek riskli hastalarda bile 6 mm'nin altındaki nodlarda malignite riski <%1'dir.6 ila 20 mm arası nodüllerde malignite riski %8 ila %64 arasında değişmektedir30.Bu nedenle Fleischner Topluluğu rutin CT takibi için 6 mm'lik bir kesim çapı önermektedir.29 Ancak 6 mm'den büyük belirsiz pulmoner nodüllerin (IPN) risk değerlendirmesi ve yönetimi yeterince yapılmamıştır31.Konjenital kalp hastalığının mevcut yönetimi genellikle sık BT izlemesi ile dikkatli beklemeye dayanmaktadır.
Doğrulanmış metabolomaya dayanarak, ilk kez sağlıklı bireyler ile <6 mm iyi huylu nodüller arasındaki metabolomik imzaların örtüştüğünü gösterdik.Biyolojik benzerlik, <6 mm nodüller için malignite riskinin nodül olmayan kişiler kadar düşük olduğunu gösteren daha önceki BT bulgularıyla tutarlıdır.30 Sonuçlarımızın aynı zamanda <6 mm ve ≥6 mm benign nodüllerin de yüksek malignite riski gösterdiğini gösterdiği unutulmamalıdır. Metabolomik profillerdeki benzerlik, benign etiyolojinin fonksiyonel tanımının nodül boyutundan bağımsız olarak tutarlı olduğunu düşündürmektedir.Bu nedenle, modern tanısal serum metabolit panelleri, başlangıçta BT'de nodüller tespit edildiğinde bir dışlama testi olarak tek bir tahlil sağlayabilir ve potansiyel olarak seri izlemeyi azaltabilir.Aynı zamanda, aynı metabolik biyobelirteç paneli, boyutu ≥6 mm olan malign nodülleri benign nodüllerden ayırdı ve BT görüntülerinde benzer boyuta ve belirsiz morfolojik özelliklere sahip IPN'ler için doğru tahminler sağladı.Bu serum metabolizması sınıflandırıcısı, 0,927'lik bir AUC ile ≥6 mm nodüllerin malignitesini tahmin etmede iyi performans gösterdi.Birlikte ele alındığında, sonuçlarımız benzersiz serum metabolomik imzalarının özellikle erken tümör kaynaklı metabolik değişiklikleri yansıtabileceğini ve nodül boyutundan bağımsız olarak risk belirleyicileri olarak potansiyel değere sahip olabileceğini göstermektedir.
Özellikle akciğer adenokarsinomu (LUAD) ve skuamöz hücreli karsinom (LUSC), küçük hücreli dışı akciğer kanserinin (NSCLC) ana türleridir.LUSC'nin tütün kullanımıyla güçlü bir şekilde ilişkili olduğu47 ve LUAD'ın BT taramasında tespit edilen rastlantısal akciğer nodüllerinin en yaygın histolojisi48 olduğu göz önüne alındığında, sınıflandırıcı modelimiz özellikle evre I adenokarsinom numuneleri için oluşturulmuştur.Wang ve meslektaşları ayrıca LUAD'a odaklandılar ve erken evre akciğer kanserini sağlıklı bireylerden ayırmak için lipidomik kullanarak dokuz lipit imzası belirlediler17.Mevcut sınıflandırıcı modelini 16 evre I LUSC vakası ve 74 iyi huylu nodül üzerinde test ettik ve düşük LUSC tahmin doğruluğu (AUC 0,776) gözlemledik; bu, LUAD ve LUSC'nin kendi metabolomik imzalarına sahip olabileceğini düşündürüyor.Gerçekten de LUAD ve LUSC'nin etiyoloji, biyolojik köken ve genetik anormallikler açısından farklılık gösterdiği gösterilmiştir49.Bu nedenle tarama programlarında akciğer kanserinin toplum temelli tespiti için diğer histoloji türlerinin de eğitim modellerine dahil edilmesi gerekmektedir.
Burada, sağlıklı kontroller ve iyi huylu nodüllerle karşılaştırıldığında akciğer adenokarsinomunda en sık değiştirilen altı yolu belirledik.Ksantin ve hipoksantin, pürin metabolik yolunun ortak metabolitleridir.Sonuçlarımızla tutarlı olarak, akciğer adenokarsinomu olan hastaların serumunda veya dokularında pürin metabolizması ile ilişkili ara maddeler, sağlıklı kontrollere veya preinvaziv aşamadaki hastalara kıyasla önemli ölçüde arttı15,50.Yüksek serum ksantin ve hipoksantin seviyeleri, hızla çoğalan kanser hücrelerinin ihtiyaç duyduğu anabolizmayı yansıtabilir.Glikoz metabolizmasının düzensizliği, kanser metabolizmasının iyi bilinen bir özelliğidir51.Burada, HC ve BN grubuna kıyasla LA grubunda piruvat ve laktatta önemli bir artış gözlemledik; bu, küçük hücreli dışı akciğer kanseri (NSCLC) hastalarının serum metabolom profillerindeki glikolitik yol anormalliklerine ilişkin önceki raporlarla tutarlıdır ve sağlıklı kontroller.sonuçlar tutarlıdır52,53.
Önemli olarak, akciğer adenokarsinomlarının serumunda piruvat ve triptofan metabolizması arasında ters bir korelasyon gözlemledik.LA grubunda serum triptofan seviyeleri HC veya BN grubuyla karşılaştırıldığında azaldı.İlginç bir şekilde, ileriye yönelik bir kohort kullanılarak yapılan önceki büyük ölçekli bir çalışma, dolaşımdaki düşük triptofan düzeylerinin, akciğer kanseri riskinin artmasıyla ilişkili olduğunu bulmuştur 54.Triptofan tamamen yiyeceklerden aldığımız önemli bir amino asittir.Akciğer adenokarsinomunda serum triptofan tükenmesinin bu metabolitin hızlı tükenmesini yansıtabileceği sonucuna vardık.Kinurenin yolu yoluyla triptofan katabolizmasının son ürününün, yeni NAD+ sentezinin kaynağı olduğu iyi bilinmektedir.NAD+ öncelikli olarak kurtarma yolu yoluyla üretildiğinden, NAD+'nın sağlık ve hastalıkta triptofan metabolizmasındaki önemi henüz belirlenmemiştir46.TCGA veri tabanı analizimiz, triptofan taşıyıcı çözünen taşıyıcı 7A5'in (SLC7A5) ekspresyonunun, normal kontrollerle karşılaştırıldığında akciğer adenokarsinomunda önemli ölçüde arttığını ve glikolitik enzim GAPDH'nin ekspresyonu ile pozitif korelasyon gösterdiğini gösterdi.Önceki çalışmalar esas olarak antitümör immün tepkisinin baskılanmasında triptofan katabolizmasının rolüne odaklanmıştır40,41,42.Burada, akciğer kanseri hücrelerinde SLC7A5'in yıkılması yoluyla triptofan alımının inhibisyonunun, hücresel NAD seviyelerinde müteakip bir düşüşe ve buna eşlik eden glikolitik aktivitede bir zayıflamaya yol açtığını gösterdik.Özetle çalışmamız, akciğer adenokarsinomunun malign transformasyonuyla ilişkili serum metabolizmasındaki değişiklikler için biyolojik bir temel sağlar.
EGFR mutasyonları, KHDAK'li hastalarda en sık görülen sürücü mutasyonlardır.Çalışmamızda, EGFR mutasyonlu hastaların (n = 41), vahşi tip EGFR'li hastalara (n = 31) benzer genel metabolomik profillere sahip olduğunu bulduk, ancak açilkarnitin hastalarında bazı EGFR mutant hastalarında serum seviyelerinin azaldığını bulduk.Asilkarnitinlerin yerleşik işlevi, asil gruplarını sitoplazmadan mitokondriyal matrikse taşımak, böylece enerji üretmek için yağ asitlerinin oksidasyonuna yol açmaktır55.Bulgularımızla tutarlı olarak yakın zamanda yapılan bir çalışmada, 102 akciğer adenokarsinomu doku örneğinin global metabolomunun analiz edilmesiyle EGFR mutantı ve EGFR yabani tip tümörler arasında benzer metabolom profilleri tespit edilmiştir50.İlginç bir şekilde, EGFR mutant grubunda da açilkarnitin içeriği bulundu.Bu nedenle asilkarnitin seviyelerindeki değişikliklerin EGFR'nin neden olduğu metabolik değişiklikleri yansıtıp yansıtmadığı ve altta yatan moleküler yolakların daha fazla araştırılması gerekebilir.
Sonuç olarak, çalışmamız pulmoner nodüllerin ayırıcı tanısı için bir serum metabolik sınıflandırıcı oluşturmakta ve risk değerlendirmesini optimize edebilecek ve BT tarama taramasına dayalı klinik yönetimi kolaylaştırabilecek bir iş akışı önermektedir.
Bu çalışma, Sun Yat-sen Üniversitesi Kanser Hastanesi Etik Kurulu, Sun Yat-sen Üniversitesi İlk Bağlı Hastanesi ve Zhengzhou Üniversitesi Kanser Hastanesi Etik Kurulu tarafından onaylandı.Keşif ve dahili doğrulama gruplarında, Sun Yat-sen Üniversitesi Kanser Merkezi Kanser Kontrol ve Önleme Bölümü'nde yıllık tıbbi muayeneye tabi tutulan kişilerden sağlıklı bireylerden 174 serum ve iyi huylu nodüllerden 244 serum ve 166 iyi huylu nodül toplandı.serum.Aşama I akciğer adenokarsinomları Sun Yat-sen Üniversitesi Kanser Merkezi'nden toplandı.Dış doğrulama kohortunda 48 iyi huylu nodül vakası, Sun Yat-sen Üniversitesi Birinci Bağlı Hastanesinden 39 evre I akciğer adenokarsinomu vakası ve Zhengzhou Kanser Hastanesinden 24 evre I akciğer adenokarsinomu vakası vardı.Sun Yat-sen Üniversitesi Kanser Merkezi ayrıca yerleşik metabolik sınıflandırıcının tanısal yeteneğini test etmek için 16 evre I skuamöz hücreli akciğer kanseri vakası topladı (hasta özellikleri Ek Tablo 5'te gösterilmektedir).Keşif kohortu ve dahili doğrulama kohortundan örnekler Ocak 2018 ile Mayıs 2020 arasında toplandı. Harici doğrulama kohortu için örnekler Ağustos 2021 ile Ekim 2022 arasında toplandı. Cinsiyet yanlılığını en aza indirmek için her birine yaklaşık olarak eşit sayıda erkek ve kadın vaka atandı. grup.Keşif Ekibi ve Dahili İnceleme Ekibi.Katılımcının cinsiyeti kendi beyanına göre belirlendi.Tüm katılımcılardan bilgilendirilmiş onam alındı ve herhangi bir tazminat sağlanmadı.İyi huylu nodülleri olan kişiler, ameliyat öncesi toplanan ve histopatoloji ile teşhis edilen harici doğrulama örneğinden 1 vaka hariç, analiz sırasında 2 ila 5 yıl arasında BT taraması skoru stabil olan kişilerdi.Kronik bronşit hariç.Akciğer adenokarsinomu vakaları akciğer rezeksiyonu öncesinde toplandı ve patolojik tanı ile doğrulandı.Açlık kan örnekleri antikoagülan içermeyen serum ayırma tüplerine alındı.Kan örnekleri oda sıcaklığında 1 saat pıhtılaştırıldı ve daha sonra serum süpernatanını toplamak için 2851 x g'de 4°C'de 10 dakika santrifüj edildi.Serum alikuotları metabolit ekstraksiyonuna kadar -80°C'de donduruldu.Sun Yat-sen Üniversitesi Kanser Merkezi Kanseri Önleme ve Tıbbi Muayene Departmanı, aralarında 40 ila 55 yaşları arasındaki eşit sayıda erkek ve kadının da bulunduğu 100 sağlıklı donörden bir serum havuzu topladı.Her donör örneğinin eşit hacimleri karıştırıldı, elde edilen havuz bölüntülere ayrıldı ve -80°C'de saklandı.Serum karışımı, kalite kontrol ve veri standardizasyonu için referans materyal olarak kullanıldı.
Referans serumu ve test numuneleri eritildi ve metabolitler, kombine ekstraksiyon yöntemi (MTBE/metanol/su)56 kullanılarak ekstre edildi.Kısaca, 50 ul serum, 225 ul buz soğukluğunda metanol ve 750 ul buz soğukluğunda metil tert-butil eter (MTBE) ile karıştırıldı.Karışımı karıştırın ve 1 saat boyunca buz üzerinde inkübe edin.Daha sonra numuneler karıştırıldı ve iç standartlar (Cambridge Isotope Laboratories'den satın alınan 13C-laktat, 13C3-piruvat, 13C-metiyonin ve 13C6-izolösin) içeren 188 ul MS dereceli suyla vorteksle karıştırıldı.Karışım daha sonra 4 °C'de 10 dakika boyunca 15.000 x g'de santrifüjlendi ve alt faz, pozitif ve negatif modlarda LC-MS analizi için iki tüpe (her biri 125 μL) aktarıldı.Son olarak numune, yüksek hızlı bir vakum yoğunlaştırıcıda kuruyana kadar buharlaştırıldı.
Kurutulmuş metabolitler 120 ul %80 asetonitril içerisinde yeniden oluşturuldu, 5 dakika boyunca vortekslendi ve 4°C'de 15.000 x g'de 10 dakika boyunca santrifüjlendi.Süpernatanlar, metabolomik çalışmalar için mikro kesici uçlara sahip amber renkli cam şişelere aktarıldı.Ultra performanslı sıvı kromatografisi-yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi (UPLC-HRMS) platformunda hedeflenmemiş metabolomik analiz.Metabolitler, bir Dionex Ultimate 3000 UPLC sistemi ve bir ACQUITY BEH Amid kolonu (2,1 x 100 mm, 1,7 μm, Waters) kullanılarak ayrıldı.Pozitif iyon modunda mobil fazlar %95 (A) ve %50 asetonitril (B) idi; her biri 10 mmol/L amonyum asetat ve %0,1 formik asit içeriyordu.Negatif modda, mobil fazlar A ve B sırasıyla %95 ve %50 asetonitril içeriyordu; her iki faz da 10 mmol/L amonyum asetat içeriyordu, pH = 9. Gradyan programı şu şekildeydi: 0–0,5 dakika, %2 B;0,5–12 dakika, %2–50 B;12–14 dakika, %50–98 B;14–16 dakika, %98 B;16–16.1.en az, %98 –2 B;16,1–20 dakika, %2 B. Otomatik örnekleyicide sütun 40°C'de ve numune 10°C'de tutuldu.Akış hızı 0,3 ml/dak, enjeksiyon hacmi 3 ul idi.Elektrosprey iyonizasyon (ESI) kaynağına sahip bir Q-Exactive Orbitrap kütle spektrometresi (Thermo Fisher Scientific), tam tarama modunda çalıştırıldı ve büyük miktarda veri toplamak için ddMS2 izleme moduyla birleştirildi.MS parametreleri şu şekilde ayarlandı: püskürtme voltajı +3,8 kV/- 3,2 kV, kılcal sıcaklık 320°C, koruyucu gaz 40 arb, yardımcı gaz 10 arb, prob ısıtıcı sıcaklığı 350°C, tarama aralığı 70–1050 m/saat, çözünürlük.70 000. Veriler Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific) kullanılarak elde edildi.
Veri kalitesini değerlendirmek için, her numuneden 10 μL süpernatan alikotunun çıkarılmasıyla havuzlanmış kalite kontrol (QC) numuneleri üretildi.UPLC-MS sisteminin stabilitesini değerlendirmek için analitik dizinin başlangıcında altı kalite kontrol numunesi enjeksiyonu analiz edildi.Daha sonra kalite kontrol numuneleri periyodik olarak partiye eklenir.Bu çalışmadaki 11 serum numunesi serisinin tamamı LC-MS ile analiz edildi.100 sağlıklı donörden alınan bir serum havuzu karışımının alikuotları, ekstraksiyon sürecini izlemek ve partiden partiye etkileri ayarlamak için ilgili partilerde referans materyal olarak kullanıldı.Keşif kohortunun, iç doğrulama kohortunun ve dış doğrulama kohortunun hedeflenmemiş metabolomik analizi Sun Yat-sen Üniversitesi Metabolomik Merkezi'nde gerçekleştirildi.Guangdong Teknoloji Üniversitesi Analiz ve Test Merkezi'nin harici laboratuvarı da sınıflandırıcı modelinin performansını test etmek için harici gruptan 40 örneği analiz etti.
Ekstraksiyon ve sulandırmanın ardından serum metabolitlerinin mutlak niceliği, çoklu reaksiyon izleme (MRM) modunda bir elektrosprey iyonizasyon (ESI) kaynağı ile ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisi-tandem kütle spektrometresi (Agilent 6495 üçlü dört kutuplu) kullanılarak ölçüldü.Metabolitleri ayırmak için bir ACQUITY BEH Amid kolonu (2,1 x 100 mm, 1,7 μm, Waters) kullanıldı.Mobil faz, 10 mmol/L amonyum asetat ve %0,1 amonyak çözeltisi ile %90 (A) ve %5 asetonitrilden (B) oluşuyordu.Gradyan programı şu şekildeydi: 0–1,5 dakika, %0 B;1,5–6,5 dakika, %0–15 B;6,5–8 dakika, %15 B;8–8,5 dakika, %15–%0 B;8,5–11,5 dakika, %0B.Otomatik örnekleyicide sütun 40 °C'de ve numune 10 °C'de tutuldu.Akış hızı 0,3 mL/dak ve enjeksiyon hacmi 1 μL idi.MS parametreleri şu şekilde ayarlandı: kılcal voltaj ±3,5 kV, nebülizör basıncı 35 psi, kılıf gazı akışı 12 L/dak, kılıf gazı sıcaklığı 350°C, kurutma gazı sıcaklığı 250°C ve kurutma gazı akışı 14 l/dak.Triptofan, piruvat, laktat, hipoksantin ve ksantinin MRM dönüşümleri 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 ve 151,0–107 idi.sırasıyla 9.Veriler Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies) kullanılarak toplandı.Serum örnekleri için triptofan, piruvat, laktat, hipoksantin ve ksantin, standart karışım çözeltilerinin kalibrasyon eğrileri kullanılarak ölçüldü.Hücre numuneleri için triptofan içeriği, dahili standart ve hücre protein kütlesine göre normalleştirildi.
Tepe ekstraksiyonu (m/z ve alıkonma süresi (RT), Compound Discovery 3.1 ve TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific) kullanılarak gerçekleştirildi.Gruplar arasındaki potansiyel farkları ortadan kaldırmak için, test numunesinin her bir karakteristik zirvesi, göreceli bolluğu elde etmek amacıyla aynı partiden alınan referans malzemenin karakteristik zirvesine bölündü.Standardizasyondan önce ve sonra iç standartların göreceli standart sapmaları Ek Tablo 6'da gösterilmektedir. İki grup arasındaki farklar, yanlış keşif oranı (FDR<0.05, Wilcoxon işaretli sıralama testi) ve kat değişimi (>1.2 veya <0.83) ile karakterize edildi.Çıkarılan özelliklerin ham MS verileri ve referans serumla düzeltilmiş MS verileri sırasıyla Ek Veri 1 ve Ek Veri 2'de gösterilmektedir.Zirve açıklaması, tanımlanan metabolitler, varsayılan olarak açıklamalı bileşikler, varsayılan olarak karakterize edilmiş bileşik sınıfları ve bilinmeyen bileşikler22 dahil olmak üzere dört tanımlı tanımlama düzeyine dayalı olarak gerçekleştirildi.Compound Discovery 3.1'deki (mzCloud, HMDB, Chemspider) veri tabanı aramalarına dayanarak, MS/MS ile eşleşen doğrulanmış standartlara sahip biyolojik bileşikler veya mzCloud (puan > 85) veya Chemspider'deki tam eşleşme açıklamaları, son olarak diferansiyel metabolom arasında ara ürünler olarak seçildi.Her özellik için en yüksek açıklamalar Ek Veri 3'e dahil edilmiştir. Toplam normalleştirilmiş metabolit bolluğunun tek değişkenli analizi için MetaboAnalyst 5.0 kullanıldı.MetaboAnalyst 5.0 ayrıca önemli ölçüde farklı metabolitlere dayalı KEGG yolu zenginleştirme analizini de değerlendirdi.Temel bileşen analizi (PCA) ve kısmi en küçük kareler diskriminant analizi (PLS-DA), yığın normalleştirme ve otomatik ölçeklendirme özelliğine sahip ropls yazılım paketi (v.1.26.4) kullanılarak analiz edildi.Nodül malignitesini öngörmek için en uygun metabolit biyobelirteç modeli, en az mutlak büzülme ve seçim operatörü (LASSO, R paketi v.4.1-3) ile ikili lojistik regresyon kullanılarak oluşturuldu.Ayırıcı modelin tespit ve doğrulama setlerindeki performansı, pROC paketine (v.1.18.0.) göre ROC analizine dayalı AUC'nin tahmin edilmesiyle karakterize edildi.Optimum olasılık sınırı, modelin maksimum Youden endeksine (duyarlılık + özgüllük – 1) dayalı olarak elde edildi.Eşiğin altında veya üstünde değerleri olan numunelerin sırasıyla iyi huylu nodüller ve akciğer adenokarsinomu olduğu tahmin edilecektir.
A549 hücreleri (#CCL-185, Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu), %10 FBS içeren F-12K ortamında büyütüldü.SLC7A5'i hedef alan kısa saç tokası RNA (shRNA) dizileri ve hedeflemeyen bir kontrol (NC), lentiviral vektör pLKO.1-puro'ya yerleştirildi.ShSLC7A5'in antisens dizileri şu şekildedir: Sh1 (5'-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3'), Sh2 (5'-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3').SLC7A5 (#5347) ve tübüline (#2148) karşı antikorlar, Cell Signaling Technology'den satın alınmıştır.Western blot analizi için SLC7A5 ve tübüline karşı antikorlar 1:1000 seyreltide kullanıldı.
Seahorse XF Glikolitik Stres Testi hücre dışı asitlenme (ECAR) seviyelerini ölçer.Testte, ECAR tarafından ölçülen hücresel glikolitik kapasiteyi test etmek için glikoz, oligomisin A ve 2-DG sırayla uygulandı.
Hedefleyici olmayan kontrol (NC) ve shSLC7A5 (Sh1, Sh2) ile transfekte edilmiş A549 hücreleri, gece boyunca 10 cm çapındaki tabaklara kaplandı.Hücre metabolitleri, 1 ml buz soğukluğunda %80 sulu metanol ile ekstre edildi.Metanol çözeltisindeki hücreler kazındı, yeni bir tüpte toplandı ve 15.000 x g'de 15 dakika boyunca 4°C'de santrifüjlendi.800 ul süpernatan toplayın ve yüksek hızlı bir vakum yoğunlaştırıcı kullanarak kurutun.Kurutulmuş metabolit peletleri daha sonra yukarıda açıklandığı gibi LC-MS/MS kullanılarak triptofan seviyeleri açısından analiz edildi.A549 hücrelerindeki (NC ve shSLC7A5) hücresel NAD(H) seviyeleri, üreticinin talimatlarına göre kantitatif bir NAD+/NADH kolorimetrik kiti (#K337, BioVision) kullanılarak ölçüldü.Metabolitlerin miktarını normalleştirmek için her numune için protein seviyeleri ölçüldü.
Örneklem büyüklüğünü önceden belirlemek için herhangi bir istatistiksel yöntem kullanılmamıştır.Biyobelirteç keşfini amaçlayan önceki metabolomik çalışmalar15,18 boyut belirlemede referans olarak kabul edildi ve bu raporlarla karşılaştırıldığında örneğimiz yeterliydi.Çalışma kohortundan hiçbir örnek çıkarılmadı.Hedeflenmemiş metabolomik çalışmalar için serum numuneleri rastgele bir keşif grubuna (306 vaka, %74,6) ve bir dahili doğrulama grubuna (104 vaka, %25,4) atandı.Ayrıca hedeflenen metabolomik çalışmalar için keşif setinden her gruptan rastgele 70 vaka seçtik.Araştırmacılar, LC-MS veri toplama ve analizi sırasında grup ataması konusunda kördü.Metabolomik verilerin ve hücre deneylerinin istatistiksel analizleri ilgili Sonuçlar, Şekil Açıklamaları ve Yöntemler bölümlerinde açıklanmaktadır.Hücresel triptofan, NADT ve glikolitik aktivitenin miktarının belirlenmesi, aynı sonuçlarla bağımsız olarak üç kez gerçekleştirildi.
Çalışma tasarımı hakkında daha fazla bilgi için bu makaleyle ilişkili Doğal Portföy Raporu Özeti'ne bakın.
Çıkarılan özelliklerin ham MS verileri ve referans serumun normalleştirilmiş MS verileri sırasıyla Ek Veri 1 ve Ek Veri 2'de gösterilmektedir.Diferansiyel özellikler için en yüksek açıklamalar Ek Veri 3'te sunulmaktadır. LUAD TCGA veri seti https://portal.gdc.cancer.gov/ adresinden indirilebilir.Grafiğin çizilmesi için giriş verileri kaynak verilerde sağlanır.Bu makale için kaynak veriler sağlanmıştır.
Ulusal Akciğer Tarama Çalışma Grubu vb. Düşük doz bilgisayarlı tomografi ile akciğer kanseri mortalitesinin azaltılması.Kuzey İngiltere.J. Med.365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR ve Prophet, PC Düşük doz sarmal CT kullanılarak akciğer kanseri taraması: Ulusal Akciğer Tarama Çalışmasının (NLST) sonuçları.J. Med.Ekran 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ, ve ark.Randomize bir çalışmada hacimsel BT taramasıyla akciğer kanseri mortalitesinin azaltılması.Kuzey İngiltere.J. Med.382, 503–513 (2020).
Gönderim zamanı: 18 Eylül 2023