Bilgisayarlı tomografi (BT) ile saptanan akciğer nodüllerinin ayırıcı tanısı klinik uygulamada hala bir zorluk teşkil etmektedir. Burada, sağlıklı kontroller, benign akciğer nodülleri ve evre I akciğer adenokarsinomu dahil olmak üzere 480 serum örneğinin global metabolomunu karakterize ediyoruz. Adenokarsinomlar benzersiz metabolomik profiller sergilerken, benign nodüller ve sağlıklı bireyler metabolomik profillerde yüksek benzerlik göstermektedir. Keşif grubunda (n = 306), benign ve malign nodülleri ayırt etmek için 27 metabolitten oluşan bir set tanımlandı. Ayırt edici modelin AUC değeri, iç doğrulama (n = 104) ve dış doğrulama (n = 111) gruplarında sırasıyla 0,915 ve 0,945 idi. Yol analizi, benign nodüller ve sağlıklı kontrollere kıyasla akciğer adenokarsinomu serumunda azalan triptofan ile ilişkili artmış glikolitik metabolitleri ortaya çıkardı ve triptofan alımının akciğer kanseri hücrelerinde glikolizi desteklediğini öne sürdü. Çalışmamız, BT ile tespit edilen akciğer nodüllerinin riskini değerlendirmede serum metabolit biyobelirteçlerinin önemini vurgulamaktadır.
Kanser hastalarında hayatta kalma oranlarını iyileştirmek için erken teşhis çok önemlidir. ABD Ulusal Akciğer Kanseri Tarama Çalışması (NLST) ve Avrupa NELSON Çalışması'ndan elde edilen sonuçlar, düşük dozlu bilgisayarlı tomografi (LDCT) ile taramanın yüksek risk gruplarında akciğer kanseri mortalitesini önemli ölçüde azaltabileceğini göstermiştir1,2,3. Akciğer kanseri taramasında LDCT'nin yaygın kullanımından bu yana, asemptomatik akciğer nodüllerinin tesadüfi radyografik bulgularının sıklığı artmaya devam etmiştir4. Akciğer nodülleri, çapı 3 cm'ye kadar olan fokal opaklıklar olarak tanımlanır5. Malignite olasılığını değerlendirmede ve LDCT'de tesadüfen saptanan çok sayıda akciğer nodülüyle başa çıkmada zorluklarla karşılaşıyoruz. BT'nin sınırlamaları, sık takip muayenelerine ve yanlış pozitif sonuçlara yol açarak gereksiz müdahaleye ve aşırı tedaviye neden olabilir6. Bu nedenle, akciğer kanserini erken evrelerde doğru bir şekilde tanımlamak ve ilk tespitte en iyi huylu nodülleri ayırt etmek için güvenilir ve kullanışlı biyobelirteçler geliştirmeye ihtiyaç vardır7.
Kanın (serum, plazma, periferik kan mononükleer hücreleri) kapsamlı moleküler analizi, genomik, proteomik veya DNA metilasyonu8,9,10 dahil olmak üzere, akciğer kanseri için tanısal biyobelirteçlerin keşfine olan ilgiyi artırmıştır. Bu arada, metabolomik yaklaşımlar, endojen ve eksojen etkilerden etkilenen hücresel son ürünleri ölçer ve bu nedenle hastalık başlangıcını ve sonucunu tahmin etmek için kullanılır. Sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometrisi (LC-MS), yüksek hassasiyeti ve farklı fizikokimyasal özelliklere sahip metabolitleri kapsayabilen geniş dinamik aralığı nedeniyle metabolomik çalışmalar için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir11,12,13. Plazma/serumun global metabolomik analizi, akciğer kanseri tanısı14,15,16,17 ve tedavi etkinliği18 ile ilişkili biyobelirteçleri tanımlamak için kullanılmış olsa da, benign ve malign akciğer nodülleri arasında ayrım yapmak için serum metabolit sınıflandırıcıları hala çok fazla araştırma gerektirmektedir.
Adenokarsinom ve skuamöz hücreli karsinom, küçük hücreli olmayan akciğer kanserinin (NSCLC) iki ana alt tipidir. Çeşitli BT tarama testleri, adenokarsinomun akciğer kanserinin en yaygın histolojik tipi olduğunu göstermektedir1,19,20,21. Bu çalışmada, sağlıklı kontroller, benign akciğer nodülleri ve BT ile tespit edilen ≤3 cm'lik evre I akciğer adenokarsinomu taraması dahil olmak üzere toplam 695 serum örneğinde metabolomik analiz yapmak için ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisi-yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi (UPLC-HRMS) kullandık. Akciğer adenokarsinomunu benign nodüllerden ve sağlıklı kontrollerden ayıran bir serum metabolit paneli belirledik. Yol zenginleştirme analizi, anormal triptofan ve glikoz metabolizmasının, benign nodüller ve sağlıklı kontrollerle karşılaştırıldığında akciğer adenokarsinomunda yaygın değişiklikler olduğunu ortaya koydu. Son olarak, LDCT ile saptanan malign ve benign akciğer nodüllerini ayırt etmek için yüksek özgüllük ve duyarlılığa sahip bir serum metabolik sınıflandırıcı geliştirdik ve doğruladık; bu da erken ayırıcı tanı ve risk değerlendirmesine yardımcı olabilir.
Bu çalışmada, 174 sağlıklı kontrol grubundan, 292 iyi huylu akciğer nodülü hastasından ve 229 evre I akciğer adenokarsinomu hastasından cinsiyet ve yaş açısından eşleştirilmiş serum örnekleri retrospektif olarak toplandı. 695 denek grubunun demografik özellikleri Ek Tablo 1'de gösterilmiştir.
Şekil 1a'da gösterildiği gibi, Sun Yat-sen Üniversitesi Kanser Merkezi'nde 174 sağlıklı kontrol (HC), 170 iyi huylu nodül (BN) ve 136 evre I akciğer adenokarsinomu (LA) örneği dahil olmak üzere toplam 480 serum örneği toplandı. Ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisi-yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi (UPLC-HRMS) kullanılarak hedeflenmemiş metabolomik profilleme için keşif kohortu oluşturuldu. Ek Şekil 1'de gösterildiği gibi, bir sınıflandırma modeli oluşturmak ve farklı yol analizini daha ayrıntılı incelemek için LA ve HC, LA ve BN arasındaki farklı metabolitler belirlendi. Sun Yat-sen Üniversitesi Kanser Merkezi tarafından toplanan 104 örnek ve diğer iki hastane tarafından toplanan 111 örnek sırasıyla iç ve dış doğrulamaya tabi tutuldu.
a Ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisi-yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi (UPLC-HRMS) kullanılarak global serum metabolomik analizine tabi tutulan keşif kohortundaki çalışma popülasyonu. b Çalışma kohortundan 480 serum örneğinin toplam metabolomunun kısmi en küçük kareler diskriminant analizi (PLS-DA), sağlıklı kontrolleri (HC, n = 174), iyi huylu nodülleri (BN, n = 170) ve evre I akciğer adenokarsinomunu (Los Angeles, n = 136) içermektedir. +ESI, pozitif elektrospray iyonizasyon modu, -ESI, negatif elektrospray iyonizasyon modu. c–e İki grupta anlamlı derecede farklı bolluk gösteren metabolitler (iki kuyruklu Wilcoxon işaretli sıralama testi, yanlış keşif oranı ayarlanmış p değeri, FDR <0,05) kırmızı (katlanma oranı > 1,2) ve mavi (katlanma oranı < 0,83) renkte gösterilmiştir. Volkan grafiğinde gösterilmiştir. f Hiyerarşik kümeleme ısı haritası, LA ve BN arasında açıklanan metabolit sayısındaki önemli farklılıkları göstermektedir. Kaynak veriler, kaynak veri dosyaları biçiminde sağlanmıştır.
Keşif grubundaki 174 HC, 170 BN ve 136 LA'nın toplam serum metabolomu, UPLC-HRMS analizi kullanılarak analiz edildi. İlk olarak, kalite kontrol (QC) örneklerinin, denetimsiz bir temel bileşen analizi (PCA) modelinin merkezinde sıkıca kümelendiğini ve mevcut çalışmanın performansının istikrarlı olduğunu doğruladık (Ek Şekil 2).
Şekil 1b'deki kısmi en küçük kareler ayırıcı analizinde (PLS-DA) gösterildiği gibi, pozitif (+ESI) ve negatif (−ESI) elektrosprey iyonizasyon modlarında LA ve BN, LA ve HC arasında belirgin farklılıklar olduğunu bulduk. Bununla birlikte, +ESI ve -ESI koşullarında BN ve HC arasında anlamlı bir fark bulunmadı.
LA ve HC arasında 382, LA ve BN arasında 231 ve BN ve HC arasında 95 farklı özellik bulduk (Wilcoxon işaretli sıralama testi, FDR <0,05 ve çoklu değişim >1,2 veya <0,83) (Şekil 1c-e). . Tepe noktaları ayrıca m/z değeri, tutma süresi ve parçalanma kütle spektrumu araması (ayrıntılar Yöntemler bölümünde açıklanmıştır) 22 ile bir veritabanına (mzCloud/HMDB/Chemspider kütüphanesi) karşı daha ayrıntılı olarak açıklanmıştır (Ek Veri 3). Son olarak, LA ile BN (Şekil 1f ve Ek Tablo 2) ve LA ile HC (Ek Şekil 3 ve Ek Tablo 2) için bollukta anlamlı farklılıklar gösteren 33 ve 38 açıklanmış metabolit tanımlanmıştır. Buna karşılık, BN ve HC'de bolluk açısından önemli farklılıklar gösteren yalnızca 3 metabolit tanımlandı (Ek Tablo 2), bu da PLS-DA'da BN ve HC arasındaki örtüşmeyle tutarlıdır. Bu farklı metabolitler geniş bir biyokimyasal yelpazesini kapsamaktadır (Ek Şekil 4). Toplu olarak ele alındığında, bu sonuçlar, benign akciğer nodülleri veya sağlıklı bireylerle karşılaştırıldığında, erken evre akciğer kanserinin malign dönüşümünü yansıtan serum metabolomunda önemli değişiklikler olduğunu göstermektedir. Bu arada, BN ve HC'nin serum metabolomunun benzerliği, benign akciğer nodüllerinin sağlıklı bireylerle birçok biyolojik özelliği paylaşabileceğini düşündürmektedir. Epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) gen mutasyonlarının akciğer adenokarsinomu alt tip 23'te yaygın olduğu göz önüne alındığında, sürücü mutasyonlarının serum metabolomu üzerindeki etkisini belirlemeyi amaçladık. Daha sonra, akciğer adenokarsinomu grubunda EGFR durumu olan 72 vakanın genel metabolomik profilini analiz ettik. İlginç bir şekilde, PCA analizinde EGFR mutant hastaları (n = 41) ve EGFR vahşi tip hastaları (n = 31) arasında karşılaştırılabilir profiller bulduk (Ek Şekil 5a). Bununla birlikte, EGFR mutasyonu olan hastalarda, vahşi tip EGFR'ye sahip hastalara kıyasla bolluğu önemli ölçüde değişen 7 metabolit belirledik (t testi, p < 0,05 ve kat değişim > 1,2 veya < 0,83) (Ek Şekil 5b). Bu metabolitlerin çoğunluğu (7'sinden 5'i), yağ asidi oksidasyon yollarında önemli bir rol oynayan açilkarnitinlerdir.
Şekil 2a'da gösterilen iş akışında açıklandığı gibi, nodül sınıflandırması için biyobelirteçler, en az mutlak büzülme operatörleri kullanılarak ve LA'da (n = 136) ve BN'de (n = 170) tanımlanan 33 farklı metabolite dayalı seçim yapılarak elde edildi. En iyi değişken kombinasyonu (LASSO) – ikili lojistik regresyon modeli. Modelin güvenilirliğini test etmek için on katlı çapraz doğrulama kullanıldı. Değişken seçimi ve parametre düzenlemesi, λ24 parametresiyle olasılık maksimizasyon cezası ile ayarlandı. Ayırıcı modelin sınıflandırma performansını test etmek için, global metabolomik analiz ayrıca iç doğrulama (n = 104) ve dış doğrulama (n = 111) gruplarında bağımsız olarak gerçekleştirildi. Sonuç olarak, keşif setindeki 27 metabolit, en büyük ortalama AUC değerine sahip en iyi ayırıcı model olarak tanımlandı (Şekil 2b), bunlardan 9'unun aktivitesi LA'da BN'ye kıyasla artmış, 18'inin aktivitesi ise azalmıştır (Şekil 2c).
Akciğer nodülü sınıflandırıcı oluşturma iş akışı, on katlı çapraz doğrulama yoluyla ikili lojistik regresyon modeli kullanılarak keşif setinde en iyi serum metabolit panelinin seçilmesini ve iç ve dış doğrulama setlerinde tahmin performansının değerlendirilmesini içerir. b Metabolik biyobelirteç seçimi için LASSO regresyon modelinin çapraz doğrulama istatistikleri. Yukarıda verilen sayılar, belirli bir λ'da seçilen ortalama biyobelirteç sayısını temsil eder. Kırmızı noktalı çizgi, karşılık gelen lambda'daki ortalama AUC değerini temsil eder. Gri hata çubukları minimum ve maksimum AUC değerlerini temsil eder. Noktalı çizgi, seçilen 27 biyobelirteçle en iyi modeli gösterir. AUC, alıcı işletim karakteristik (ROC) eğrisi altındaki alan. c Keşif grubunda BN grubuyla karşılaştırıldığında LA grubunda seçilen 27 metabolitin kat değişimleri. Kırmızı sütun – aktivasyon. Mavi sütun düşüşü gösterir. d–f Keşif, iç ve dış doğrulama setlerinde 27 metabolit kombinasyonuna dayalı ayırıcı modelin gücünü gösteren alıcı işletim karakteristik (ROC) eğrileri. Kaynak veriler, kaynak veri dosyaları biçiminde sağlanmıştır.
Bu 27 metabolitin ağırlıklı regresyon katsayılarına dayalı bir tahmin modeli oluşturuldu (Ek Tablo 3). Bu 27 metabolite dayalı ROC analizi, eğri altındaki alan (AUC) değerini 0,933, keşif grubu duyarlılığını 0,868 ve özgüllüğünü 0,859 olarak verdi (Şekil 2d). Bu arada, LA ve HC arasındaki 38 farklı metabolit arasında, 16 metabolitten oluşan bir küme, LA'yı HC'den ayırt etmede 0,902'lik bir AUC, 0,801'lik bir duyarlılık ve 0,856'lık bir özgüllük elde etti (Ek Şekil 6a-c). Farklı metabolitler için farklı kat değişim eşiklerine dayalı AUC değerleri de karşılaştırıldı. Sınıflandırma modelinin, katlanma değişim seviyesi 1,2'ye ayarlandığında LA ve BN (HC) arasında ayrım yapmada en iyi performansı gösterdiğini bulduk (Ek Şekil 7a,b). 27 metabolit grubuna dayalı sınıflandırma modeli, iç ve dış kohortlarda ayrıca doğrulandı. AUC, iç doğrulama için 0,915 (duyarlılık 0,867, özgüllük 0,811) ve dış doğrulama için 0,945 (duyarlılık 0,810, özgüllük 0,979) idi (Şekil 2e, f). Laboratuvarlar arası verimliliği değerlendirmek için, dış kohorttan 40 örnek, Yöntemler bölümünde açıklandığı gibi harici bir laboratuvarda analiz edildi. Sınıflandırma doğruluğu 0,925'lik bir AUC elde etti (Ek Şekil 8). Akciğer skuamöz hücreli karsinomu (LUSC), akciğer adenokarsinomundan (LUAD) sonra küçük hücreli olmayan akciğer kanserinin (NSCLC) ikinci en yaygın alt tipi olduğundan, metabolik profillerin doğrulanmış potansiyel faydasını da test ettik. BN ve 16 LUSC vakası incelendi. LUSC ve BN arasındaki ayrımın AUC değeri 0,776 idi (Ek Şekil 9), bu da LUAD ve BN arasındaki ayrım yeteneğine kıyasla daha düşük bir yeteneği göstermektedir.
Çalışmalar, BT görüntülerindeki nodül boyutunun malignite olasılığı ile pozitif korelasyon gösterdiğini ve nodül tedavisinin önemli bir belirleyicisi olmaya devam ettiğini göstermiştir25,26,27. NELSON tarama çalışmasının büyük kohortundan elde edilen verilerin analizi, 5 mm'den küçük nodülleri olan deneklerde malignite riskinin, nodülleri olmayan deneklerdeki riskle bile benzer olduğunu göstermiştir28. Bu nedenle, düzenli BT izlemesi gerektiren minimum boyut, İngiliz Toraks Derneği (BTS) tarafından önerildiği gibi 5 mm ve Fleischner Derneği tarafından önerildiği gibi 6 mm'dir29. Bununla birlikte, 6 mm'den büyük ve belirgin benign özellikler göstermeyen, belirsiz pulmoner nodüller (IPN) olarak adlandırılan nodüller, klinik uygulamada değerlendirme ve yönetimde önemli bir zorluk olmaya devam etmektedir30,31. Daha sonra, keşif ve iç doğrulama kohortlarından birleştirilmiş örnekler kullanarak nodül boyutunun metabolomik imzaları etkileyip etkilemediğini inceledik. 27 doğrulanmış biyobelirtece odaklanarak, ilk olarak HC ve BN 6 mm altı metabolomlarının PCA profillerini karşılaştırdık. HC ve BN için veri noktalarının çoğunun örtüştüğünü ve her iki grupta da serum metabolit seviyelerinin benzer olduğunu bulduk (Şekil 3a). Farklı boyut aralıklarındaki özellik haritaları BN ve LA'da korunurken (Şekil 3b, c), 6-20 mm aralığında malign ve benign nodüller arasında bir ayrım gözlemlendi (Şekil 3d). Bu kohort, 6 ila 20 mm ölçülerindeki nodüllerin malignitesini tahmin etmede 0,927 AUC, 0,868 özgüllük ve 0,820 duyarlılık değerlerine sahipti (Şekil 3e, f). Sonuçlarımız, sınıflandırıcının nodül boyutundan bağımsız olarak erken malign dönüşümün neden olduğu metabolik değişiklikleri yakalayabildiğini göstermektedir.
a) 27 metabolitten oluşan bir metabolik sınıflandırıcıya dayalı olarak belirtilen gruplar arasında PCA profillerinin karşılaştırılması. CC ve BN < 6 mm. b) BN < 6 mm ile BN 6–20 mm karşılaştırması. g) LA 6–20 mm ile LA 20–30 mm karşılaştırması. g) BN 6–20 mm ve LA 6–20 mm. GC, n = 174; BN < 6 mm, n = 153; BN 6–20 mm, n = 91; LA 6–20 mm, n = 89; LA 20–30 mm, n = 77. e) 6–20 mm nodüller için ayırıcı model performansını gösteren alıcı işletim karakteristik (ROC) eğrisi. f) Olasılık değerleri, 6–20 mm ölçüsündeki nodüller için lojistik regresyon modeline göre hesaplanmıştır. Gri noktalı çizgi, optimal kesme değerini (0,455) temsil eder. Yukarıdaki sayılar, Los Angeles için öngörülen vaka yüzdesini temsil etmektedir. İki yönlü Student's t testi kullanılmıştır. PCA, temel bileşen analizi anlamına gelir. AUC, eğri altındaki alanı ifade eder. Kaynak veriler, kaynak veri dosyaları şeklinde sağlanmıştır.
Önerilen malignite tahmin modelinin performansını göstermek için benzer akciğer nodülü boyutlarına (7-9 mm) sahip dört örnek (44-61 yaş arası) daha seçildi (Şekil 4a, b). İlk taramada, Vaka 1, benignite ile ilişkili bir özellik olan kalsifikasyonlu katı bir nodül olarak ortaya çıkarken, Vaka 2, belirgin benign özellikler göstermeyen belirsiz, kısmen katı bir nodül olarak ortaya çıktı. Üç tur takip BT taraması, bu vakaların 4 yıllık bir süre boyunca stabil kaldığını ve bu nedenle benign nodüller olarak kabul edildiğini gösterdi (Şekil 4a). Seri BT taramalarının klinik değerlendirmesiyle karşılaştırıldığında, mevcut sınıflandırıcı modelle tek seferlik serum metabolit analizi, olasılıksal kısıtlamalara dayanarak bu benign nodülleri hızlı ve doğru bir şekilde tanımladı (Tablo 1). Vaka 3'teki Şekil 4b, çoğunlukla malignite ile ilişkili olan plevral retraksiyon belirtileri gösteren bir nodülü göstermektedir32. Vaka 4, benign bir nedene dair hiçbir kanıt bulunmayan belirsiz, kısmen katı bir nodül olarak ortaya çıktı. Sınıflandırıcı modele göre tüm bu vakalar malign olarak tahmin edildi (Tablo 1). Akciğer adenokarsinomunun değerlendirilmesi, akciğer rezeksiyon ameliyatından sonra histopatolojik inceleme ile gösterildi (Şekil 4b). Dış doğrulama seti için, metabolik sınıflandırıcı 6 mm'den büyük belirsiz akciğer nodüllerinin iki vakasını doğru bir şekilde tahmin etti (Ek Şekil 10).
İki iyi huylu nodül vakasının akciğerlerinin aksiyal pencere BT görüntüleri. 1. vakada, 4 yıl sonra yapılan BT taramasında sağ alt lobda kalsifikasyonlu, 7 mm boyutunda stabil bir katı nodül görüldü. 2. vakada, 5 yıl sonra yapılan BT taramasında sağ üst lobda 7 mm çapında, kısmen katı, stabil bir nodül saptandı. b Akciğer rezeksiyonu öncesi evre I adenokarsinomlu iki vakanın akciğerlerinin aksiyal pencere BT görüntüleri ve ilgili patolojik incelemeleri. 3. vakada sağ üst lobda plevral retraksiyonlu, 8 mm çapında bir nodül saptandı. 4. vakada sol üst lobda 9 mm boyutunda, kısmen katı, buzlu cam görünümünde bir nodül saptandı. Rezeke edilen akciğer dokusunun hematoksilen ve eozin (H&E) boyaması (ölçek çubuğu = 50 μm), akciğer adenokarsinomunun asiner büyüme modelini göstermektedir. Oklar, BT görüntülerinde saptanan nodülleri göstermektedir. H&E görüntüleri, patolog tarafından incelenen birden fazla (>3) mikroskopik alanın temsili görüntüleridir.
Sonuçlarımız bir bütün olarak ele alındığında, BT taramasının değerlendirilmesinde zorluklar yaratabilecek akciğer nodüllerinin ayırıcı tanısında serum metabolit biyobelirteçlerinin potansiyel değerini göstermektedir.
Doğrulanmış bir diferansiyel metabolit paneline dayanarak, önemli metabolik değişikliklerin biyolojik korelasyonlarını belirlemeyi amaçladık. MetaboAnalyst tarafından yapılan KEGG yol zenginleştirme analizi, iki grup arasında (LA ile HC ve LA ile BN, düzeltilmiş p ≤ 0,001, etki > 0,01) ortak olarak anlamlı şekilde değişen 6 yolu belirledi. Bu değişiklikler, piruvat metabolizması, triptofan metabolizması, niasin ve nikotinamid metabolizması, glikoliz, TCA döngüsü ve pürin metabolizmasındaki bozulmalarla karakterize edildi (Şekil 5a). Daha sonra, mutlak kantifikasyon kullanarak önemli değişiklikleri doğrulamak için hedefli metabolomik analiz gerçekleştirdik. Ortak olarak değişen yollardaki ortak metabolitlerin belirlenmesi, otantik metabolit standartları kullanılarak üçlü dörtlü kütle spektrometresi (QQQ) ile yapıldı. Metabolomik çalışma hedef örnekleminin demografik özellikleri Ek Tablo 4'te yer almaktadır. Küresel metabolomik sonuçlarımızla tutarlı olarak, kantitatif analiz, hipoksantin ve ksantin, piruvat ve laktatın LA'da BN ve HC'ye kıyasla arttığını doğruladı (Şekil 5b, c, p <0,05). Bununla birlikte, bu metabolitlerde BN ve HC arasında anlamlı bir fark bulunmadı.
LA grubunda BN ve HC gruplarına kıyasla anlamlı derecede farklı metabolitlerin KEGG yol zenginleştirme analizi. İki yönlü Globaltest kullanıldı ve p değerleri Holm-Bonferroni yöntemi kullanılarak ayarlandı (ayarlanmış p ≤ 0,001 ve etki boyutu > 0,01). b–d LC-MS/MS ile belirlenen serum HC, BN ve LA'daki hipoksantin, ksantin, laktat, piruvat ve triptofan seviyelerini gösteren keman grafikleri (grup başına n = 70). Beyaz ve siyah noktalı çizgiler sırasıyla medyanı ve çeyrekleri göstermektedir. e LUAD-TCGA veri setinde akciğer adenokarsinomunda (n = 513) normal akciğer dokusuna (n = 59) kıyasla SLC7A5 ve QPRT'nin normalleştirilmiş Log2TPM (milyon başına transkript) mRNA ekspresyonunu gösteren keman grafiği. Beyaz kutu çeyrekler arası aralığı, ortadaki yatay siyah çizgi medyanı ve kutudan uzanan dikey siyah çizgi %95 güven aralığını (GA) temsil eder. f TCGA veri setindeki akciğer adenokarsinomunda (n = 513) ve normal akciğer dokusunda (n = 59) SLC7A5 ve GAPDH ekspresyonunun Pearson korelasyon grafiği. Gri alan %95 GA'yı temsil eder. r, Pearson korelasyon katsayısı. g LC-MS/MS ile belirlenen, spesifik olmayan shRNA kontrolü (NC) ve shSLC7A5 (Sh1, Sh2) ile transfekte edilmiş A549 hücrelerindeki normalize edilmiş hücresel triptofan seviyeleri. Her gruptaki beş biyolojik olarak bağımsız örneğin istatistiksel analizi sunulmuştur. h A549 hücrelerinde (NC) ve SLC7A5 gen susturulmuş A549 hücrelerinde (Sh1, Sh2) NADt (toplam NAD, NAD+ ve NADH dahil) hücresel seviyeleri. Her gruptaki üç biyolojik olarak bağımsız örneğin istatistiksel analizi sunulmuştur. i SLC7A5 geninin susturulmasından önce ve sonra A549 hücrelerinin glikolitik aktivitesi, hücre dışı asitleşme oranı (ECAR) ile ölçülmüştür (grup başına n = 4 biyolojik olarak bağımsız örnek). 2-DG,2-deoksi-D-glukoz. (b–h)'de iki kuyruklu Student's t testi kullanılmıştır. (g–i)'de hata çubukları ortalama ± standart sapmayı temsil eder, her deney üç kez bağımsız olarak tekrarlanmış ve sonuçlar benzer olmuştur. Kaynak veriler, kaynak veri dosyaları şeklinde sağlanmıştır.
LA grubunda triptofan metabolizmasındaki değişikliklerin önemli etkisini göz önünde bulundurarak, QQQ kullanarak HC, BN ve LA gruplarındaki serum triptofan düzeylerini de değerlendirdik. Serum triptofan düzeyinin LA grubunda HC veya BN gruplarına kıyasla daha düşük olduğunu bulduk (p < 0.001, Şekil 5d), bu da dolaşımdaki triptofan düzeylerinin akciğer kanseri hastalarında kontrol grubundaki sağlıklı bireylere göre daha düşük olduğu yönündeki önceki bulgularla tutarlıdır33,34,35. PET/CT izleyicisi 11C-metil-L-triptofan kullanan başka bir çalışmada, akciğer kanseri dokusundaki triptofan sinyal tutma süresinin benign lezyonlara veya normal dokuya kıyasla önemli ölçüde arttığı bulunmuştur36. LA serumundaki triptofan azalmasının, akciğer kanseri hücreleri tarafından aktif triptofan alımını yansıtabileceğini varsayıyoruz.
Triptofan katabolizmasının kynurenin yolunun son ürününün NAD+37,38 olduğu ve bunun glikolizde gliser aldehit-3-fosfatın 1,3-bisfosfogliserat ile reaksiyonu için önemli bir substrat olduğu da bilinmektedir39. Önceki çalışmalar triptofan katabolizmasının bağışıklık düzenlemesindeki rolüne odaklanırken, biz mevcut çalışmada gözlemlenen triptofan düzensizliği ile glikolitik yollar arasındaki etkileşimi aydınlatmayı amaçladık. Çözücü taşıyıcı ailesi 7 üyesi 5 (SLC7A5) bir triptofan taşıyıcısı olarak bilinmektedir43,44,45. Kinolinik asit fosforiboziltransferaz (QPRT), kinolinik asidi NAMN'ye dönüştüren kynurenin yolunun aşağısında yer alan bir enzimdir46. LUAD TCGA veri setinin incelenmesi, hem SLC7A5 hem de QPRT'nin normal dokuya kıyasla tümör dokusunda önemli ölçüde yukarı regüle edildiğini ortaya koymuştur (Şekil 5e). Bu artış, akciğer adenokarsinomunun I ve II evrelerinin yanı sıra III ve IV evrelerinde de gözlemlenmiştir (Ek Şekil 11), bu da tümör oluşumuyla ilişkili triptofan metabolizmasındaki erken bozulmaları göstermektedir.
Ek olarak, LUAD-TCGA veri seti, kanser hastası örneklerinde SLC7A5 ve GAPDH mRNA ekspresyonu arasında pozitif bir korelasyon gösterdi (r = 0,45, p = 1,55E-26, Şekil 5f). Buna karşılık, normal akciğer dokusunda bu gen imzaları arasında anlamlı bir korelasyon bulunmadı (r = 0,25, p = 0,06, Şekil 5f). A549 hücrelerinde SLC7A5'in baskılanması (Ek Şekil 12), hücresel triptofan ve NAD(H) seviyelerini önemli ölçüde azalttı (Şekil 5g,h), bu da hücre dışı asitleşme oranı (ECAR) ile ölçülen glikolitik aktivitenin zayıflamasına neden oldu (Şekil 1). 5i). Bu nedenle, serumdaki metabolik değişikliklere ve in vitro tespitlere dayanarak, triptofan metabolizmasının kynurenin yoluyla NAD+ üretebileceğini ve akciğer kanserinde glikolizi teşvik etmede önemli bir rol oynayabileceğini varsayıyoruz.
Çalışmalar, LDCT ile saptanan çok sayıda belirsiz akciğer nodülünün, PET-CT, akciğer biyopsisi gibi ek testlere ve malignite yanlış pozitif tanısı nedeniyle aşırı tedaviye yol açabileceğini göstermiştir.31 Şekil 6'da gösterildiği gibi, çalışmamız, BT ile saptanan akciğer nodüllerinin risk sınıflandırmasını ve sonraki yönetimini iyileştirebilecek potansiyel tanısal değere sahip bir serum metabolitleri paneli belirlemiştir.
Akciğer nodülleri, benign veya malign nedenleri düşündüren görüntüleme özelliklerine sahip düşük dozlu bilgisayarlı tomografi (LDCT) kullanılarak değerlendirilir. Nodüllerin belirsiz sonucu, sık takip ziyaretlerine, gereksiz müdahalelere ve aşırı tedaviye yol açabilir. Tanısal değeri olan serum metabolik sınıflandırıcılarının dahil edilmesi, risk değerlendirmesini ve akciğer nodüllerinin sonraki yönetimini iyileştirebilir. PET (pozitron emisyon tomografisi).
ABD'deki NLST çalışması ve Avrupa'daki NELSON çalışmasından elde edilen veriler, düşük dozlu bilgisayarlı tomografi (LDCT) ile yüksek risk gruplarının taranmasının akciğer kanseri mortalitesini azaltabileceğini göstermektedir1,3. Bununla birlikte, LDCT ile tespit edilen çok sayıda tesadüfi akciğer nodülünün risk değerlendirmesi ve ardından gelen klinik yönetimi en zorlu kısım olmaya devam etmektedir. Ana amaç, güvenilir biyobelirteçleri entegre ederek mevcut LDCT tabanlı protokollerin doğru sınıflandırılmasını optimize etmektir.
Akciğer kanseri ile sağlıklı kontroller karşılaştırılarak kan metabolitleri gibi bazı moleküler biyobelirteçler tanımlanmıştır15,17. Mevcut çalışmada, LDCT ile tesadüfen saptanan benign ve malign akciğer nodüllerini ayırt etmek için serum metabolomik analizinin uygulanmasına odaklandık. UPLC-HRMS analizi kullanarak sağlıklı kontrol (HC), benign akciğer nodülleri (BN) ve evre I akciğer adenokarsinomu (LA) örneklerinin global serum metabolomunu karşılaştırdık. HC ve BN'nin benzer metabolik profillere sahip olduğunu, LA'nın ise HC ve BN'ye kıyasla önemli değişiklikler gösterdiğini bulduk. LA'yı HC ve BN'den ayıran iki serum metabolit seti belirledik.
İyi huylu ve kötü huylu nodüllerin mevcut LDCT tabanlı tanımlama şeması, esas olarak nodüllerin boyutuna, yoğunluğuna, morfolojisine ve zaman içindeki büyüme hızına dayanmaktadır30. Önceki çalışmalar, nodül boyutunun akciğer kanseri olasılığıyla yakından ilişkili olduğunu göstermiştir. Yüksek riskli hastalarda bile, 6 mm'den küçük nodüllerde malignite riski %1'den azdır. 6 ila 20 mm arasında ölçülen nodüller için malignite riski %8 ila %64 arasında değişmektedir30. Bu nedenle, Fleischner Derneği rutin BT takibi için 6 mm'lik bir kesme çapı önermektedir.29 Bununla birlikte, 6 mm'den büyük belirsiz pulmoner nodüllerin (IPN) risk değerlendirmesi ve yönetimi yeterince yapılmamıştır31. Konjenital kalp hastalığının mevcut yönetimi genellikle sık BT izlemesi ile dikkatli gözleme dayanmaktadır.
Doğrulanan metabolom temel alınarak, sağlıklı bireyler ile 6 mm'den küçük benign nodüller arasındaki metabolomik imzaların örtüşmesini ilk kez gösterdik. Biyolojik benzerlik, 6 mm'den küçük nodüller için malignite riskinin nodül olmayan kişilerdeki kadar düşük olduğunu gösteren önceki BT bulgularıyla tutarlıdır.30 Sonuçlarımızın ayrıca 6 mm'den küçük ve 6 mm'den büyük benign nodüllerin metabolomik profillerinde yüksek benzerlik gösterdiğini ve benign etiyolojinin fonksiyonel tanımının nodül boyutundan bağımsız olarak tutarlı olduğunu gösterdiğini belirtmek gerekir. Bu nedenle, modern tanısal serum metabolit panelleri, nodüller BT'de ilk kez tespit edildiğinde tek bir test olarak dışlama testi sağlayabilir ve potansiyel olarak seri izlemeyi azaltabilir. Aynı zamanda, aynı metabolik biyobelirteç paneli, 6 mm'den büyük malign nodülleri benign nodüllerden ayırt etti ve BT görüntülerinde benzer boyutta ve belirsiz morfolojik özelliklere sahip IPN'ler için doğru tahminler sağladı. Bu serum metabolizması sınıflandırıcısı, 0,927'lik AUC değeriyle 6 mm ve üzeri nodüllerin malignitesini tahmin etmede iyi bir performans sergiledi. Sonuç olarak, bulgularımız, benzersiz serum metabolomik imzalarının, tümör kaynaklı erken metabolik değişiklikleri özel olarak yansıtabileceğini ve nodül boyutundan bağımsız olarak risk belirleyici olarak potansiyel değere sahip olduğunu göstermektedir.
Özellikle akciğer adenokarsinomu (LUAD) ve skuamöz hücreli karsinom (LUSC), küçük hücreli olmayan akciğer kanserinin (NSCLC) ana tipleridir. LUSC'nin tütün kullanımıyla güçlü bir şekilde ilişkili olduğu47 ve LUAD'nin BT taramasında saptanan tesadüfi akciğer nodüllerinin en yaygın histolojisi olduğu48 göz önüne alındığında, sınıflandırıcı modelimiz özellikle evre I adenokarsinom örnekleri için oluşturulmuştur. Wang ve meslektaşları da LUAD'ye odaklanmış ve erken evre akciğer kanserini sağlıklı bireylerden ayırt etmek için lipidomik kullanarak dokuz lipid imzası belirlemiştir17. Mevcut sınıflandırıcı modelini 16 evre I LUSC vakası ve 74 iyi huylu nodül üzerinde test ettik ve düşük LUSC tahmin doğruluğu (AUC 0.776) gözlemledik; bu da LUAD ve LUSC'nin kendi metabolomik imzalarına sahip olabileceğini düşündürmektedir. Gerçekten de, LUAD ve LUSC'nin etiyoloji, biyolojik köken ve genetik sapmalar açısından farklılık gösterdiği gösterilmiştir49. Bu nedenle, akciğer kanseri tarama programlarında popülasyon bazlı tespit için kullanılan eğitim modellerine diğer histoloji türleri de dahil edilmelidir.
Burada, sağlıklı kontroller ve benign nodüllerle karşılaştırıldığında akciğer adenokarsinomunda en sık değişime uğrayan altı yolu belirledik. Ksantin ve hipoksantin, pürin metabolik yolunun yaygın metabolitleridir. Sonuçlarımızla tutarlı olarak, pürin metabolizmasıyla ilişkili ara maddeler, sağlıklı kontrollere veya invaziv olmayan evredeki hastalara kıyasla akciğer adenokarsinomlu hastaların serumunda veya dokularında önemli ölçüde artmıştır15,50. Yüksek serum ksantin ve hipoksantin seviyeleri, hızla çoğalan kanser hücreleri tarafından gerekli olan anabolizmayı yansıtabilir. Glikoz metabolizmasının düzensizliği, kanser metabolizmasının iyi bilinen bir özelliğidir51. Burada, LA grubunda HC ve BN grubuna kıyasla piruvat ve laktatta önemli bir artış gözlemledik; bu, küçük hücreli olmayan akciğer kanseri (NSCLC) hastalarının ve sağlıklı kontrollerin serum metabolom profillerinde glikolitik yol anormalliklerine ilişkin önceki raporlarla tutarlıdır52,53.
Önemli olarak, akciğer adenokarsinomlu hastaların serumunda piruvat ve triptofan metabolizması arasında ters bir korelasyon gözlemledik. Serum triptofan seviyeleri, HC veya BN grubuna kıyasla LA grubunda düşüktü. İlginç bir şekilde, prospektif bir kohort kullanan önceki büyük ölçekli bir çalışma, dolaşımdaki triptofan seviyelerinin düşük olmasının akciğer kanseri riskinde artışla ilişkili olduğunu bulmuştur 54. Triptofan, tamamen besinlerden aldığımız temel bir amino asittir. Akciğer adenokarsinomunda serum triptofan tükenmesinin bu metabolitin hızlı tükenmesini yansıttığı sonucuna varıyoruz. Triptofan katabolizmasının kynurenin yoluyla son ürününün de novo NAD+ sentezinin kaynağı olduğu iyi bilinmektedir. NAD+ öncelikle kurtarma yoluyla üretildiğinden, NAD+'nın sağlık ve hastalıkta triptofan metabolizmasındaki önemi henüz belirlenmemiştir 46. TCGA veri tabanındaki analizimiz, triptofan taşıyıcı çözücü taşıyıcı 7A5'in (SLC7A5) ekspresyonunun normal kontrollere kıyasla akciğer adenokarsinomunda önemli ölçüde arttığını ve glikolitik enzim GAPDH'nin ekspresyonuyla pozitif korelasyon gösterdiğini ortaya koymuştur. Önceki çalışmalar esas olarak triptofan katabolizmasının antitümör immün yanıtı baskılamadaki rolüne odaklanmıştır40,41,42. Burada, akciğer kanseri hücrelerinde SLC7A5'in baskılanmasıyla triptofan alımının inhibisyonunun, hücresel NAD seviyelerinde bir azalmaya ve eş zamanlı olarak glikolitik aktivitede bir zayıflamaya yol açtığını gösteriyoruz. Özetle, çalışmamız akciğer adenokarsinomunun malign dönüşümüyle ilişkili serum metabolizmasındaki değişiklikler için biyolojik bir temel sağlamaktadır.
EGFR mutasyonları, küçük hücreli olmayan akciğer kanseri (NSCLC) hastalarında en sık görülen sürücü mutasyonlardır. Çalışmamızda, EGFR mutasyonu olan hastaların (n = 41) genel metabolomik profillerinin, vahşi tip EGFR'ye sahip hastalarla (n = 31) benzer olduğunu bulduk; ancak asilkarinitin içeren bazı EGFR mutant hastalarında serum seviyelerinde azalma tespit ettik. Asilkarinitinlerin bilinen işlevi, asil gruplarını sitoplazmadan mitokondriyal matrikse taşımak ve böylece yağ asitlerinin oksidasyonunu sağlayarak enerji üretmektir 55. Bulgularımızla tutarlı olarak, yakın zamanda yapılan bir çalışma da 102 akciğer adenokarsinomu doku örneğinin global metabolomunu analiz ederek EGFR mutant ve EGFR vahşi tip tümörler arasında benzer metabolom profilleri belirlemiştir 50. İlginç bir şekilde, asilkarinitin içeriği EGFR mutant grubunda da bulunmuştur. Bu nedenle, asilkarinitin seviyelerindeki değişikliklerin EGFR kaynaklı metabolik değişiklikleri ve altta yatan moleküler yolları yansıtıp yansıtmadığı daha fazla araştırma gerektirebilir.
Sonuç olarak, çalışmamız akciğer nodüllerinin ayırıcı tanısı için bir serum metabolik sınıflandırıcı oluşturmakta ve BT taraması temelinde risk değerlendirmesini optimize edebilecek ve klinik yönetimi kolaylaştırabilecek bir iş akışı önermektedir.
Bu çalışma, Sun Yat-sen Üniversitesi Kanser Hastanesi, Sun Yat-sen Üniversitesi Birinci Bağlı Hastanesi ve Zhengzhou Üniversitesi Kanser Hastanesi Etik Kurulları tarafından onaylanmıştır. Keşif ve iç doğrulama gruplarında, Sun Yat-sen Üniversitesi Kanser Merkezi Kanser Kontrol ve Önleme Bölümü'nde yıllık tıbbi muayeneden geçen bireylerden 174 sağlıklı birey serumu ve 244 iyi huylu nodül serumu ile Sun Yat-sen Üniversitesi Kanser Merkezi'nden 166 iyi huylu nodül serumu (evre I akciğer adenokarsinomu) toplanmıştır. Dış doğrulama kohortunda ise Sun Yat-sen Üniversitesi Birinci Bağlı Hastanesi'nden 48 iyi huylu nodül vakası, 39 evre I akciğer adenokarsinomu vakası ve Zhengzhou Kanser Hastanesi'nden 24 evre I akciğer adenokarsinomu vakası bulunmaktadır. Sun Yat-sen Üniversitesi Kanser Merkezi ayrıca, oluşturulan metabolik sınıflandırıcının tanısal yeteneğini test etmek için evre I skuamöz hücreli akciğer kanseri olan 16 vaka topladı (hasta özellikleri Ek Tablo 5'te gösterilmiştir). Keşif kohortundan ve iç doğrulama kohortundan örnekler Ocak 2018 ile Mayıs 2020 arasında toplandı. Dış doğrulama kohortundan örnekler Ağustos 2021 ile Ekim 2022 arasında toplandı. Cinsiyet yanlılığını en aza indirmek için, her kohorta yaklaşık olarak eşit sayıda erkek ve kadın vaka atandı. Keşif Ekibi ve İç İnceleme Ekibi. Katılımcıların cinsiyeti kendi beyanlarına göre belirlendi. Tüm katılımcılardan bilgilendirilmiş onam alındı ve herhangi bir tazminat sağlanmadı. İyi huylu nodülleri olan denekler, analiz sırasında 2 ila 5 yıl içinde stabil bir BT tarama skoruna sahip olanlardı; dış doğrulama örneğinden ameliyat öncesi toplanan ve histopatoloji ile teşhis edilen 1 vaka hariç. Kronik bronşit hariç. Akciğer adenokarsinomu vakaları, akciğer rezeksiyonundan önce toplanmış ve patolojik tanı ile doğrulanmıştır. Açlık kan örnekleri, herhangi bir antikoagülan içermeyen serum ayırma tüplerine alınmıştır. Kan örnekleri oda sıcaklığında 1 saat pıhtılaştırılmış ve daha sonra serum süpernatantı toplamak için 4°C'de 10 dakika boyunca 2851 × g'de santrifüj edilmiştir. Serum örnekleri, metabolit ekstraksiyonuna kadar -80°C'de dondurulmuştur. Sun Yat-sen Üniversitesi Kanser Merkezi Kanser Önleme ve Tıbbi Muayene Bölümü, 40 ila 55 yaşları arasında eşit sayıda erkek ve kadın olmak üzere 100 sağlıklı donörden bir serum havuzu toplamıştır. Her donör örneğinden eşit hacimler karıştırılmış, elde edilen havuz bölümlere ayrılmış ve -80°C'de saklanmıştır. Serum karışımı, kalite kontrolü ve veri standardizasyonu için referans materyal olarak kullanılmıştır.
Referans serum ve test örnekleri çözüldü ve metabolitler, kombine bir ekstraksiyon yöntemi (MTBE/metanol/su) 56 kullanılarak ekstrakte edildi. Kısaca, 50 μl serum, 225 μl buz gibi soğuk metanol ve 750 μl buz gibi soğuk metil tert-bütil eter (MTBE) ile karıştırıldı. Karışım karıştırıldı ve 1 saat boyunca buz üzerinde bekletildi. Daha sonra örnekler, dahili standartlar (Cambridge Isotope Laboratories'den satın alınan 13C-laktat, 13C3-piruvat, 13C-metiyonin ve 13C6-izolösin) içeren 188 μl MS sınıfı su ile karıştırıldı ve vorteks karıştırıcıda çalkalandı. Karışım daha sonra 4 °C'de 10 dakika boyunca 15.000 × g'de santrifüjlendi ve alt faz, pozitif ve negatif modlarda LC-MS analizi için iki tüpe (her biri 125 μL) aktarıldı. Son olarak, numune yüksek hızlı bir vakumlu yoğunlaştırıcıda kurutularak tamamen buharlaştırıldı.
Kurutulmuş metabolitler 120 μl %80 asetonitril içinde yeniden çözündürüldü, 5 dakika boyunca vorteks ile karıştırıldı ve 4°C'de 10 dakika boyunca 15.000 × g'de santrifüjlendi. Süpernatantlar, metabolomik çalışmalar için mikro ek parçalı kehribar renkli cam şişelere aktarıldı. Hedefsiz metabolomik analiz, ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisi-yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi (UPLC-HRMS) platformunda gerçekleştirildi. Metabolitler, bir Dionex Ultimate 3000 UPLC sistemi ve bir ACQUITY BEH Amide kolonu (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters) kullanılarak ayrıştırıldı. Pozitif iyon modunda, hareketli fazlar %95 (A) ve %50 asetonitril (B) olup, her biri 10 mmol/L amonyum asetat ve %0,1 formik asit içeriyordu. Negatif modda, mobil fazlar A ve B sırasıyla %95 ve %50 asetonitril içeriyordu; her iki faz da 10 mmol/L amonyum asetat içeriyordu, pH = 9. Gradyan programı şu şekildeydi: 0–0,5 dk, %2 B; 0,5–12 dk, %2–50 B; 12–14 dk, %50–98 B; 14–16 dk, %98 B; 16–16,1 dk, %98–2 B; 16,1–20 dk, %2 B. Kolon 40°C'de, numune ise otomatik numuneleyicide 10°C'de tutuldu. Akış hızı 0,3 ml/dk, enjeksiyon hacmi 3 μl idi. Elektrosprey iyonizasyon (ESI) kaynağına sahip bir Q-Exactive Orbitrap kütle spektrometresi (Thermo Fisher Scientific), tam tarama modunda çalıştırıldı ve büyük veri hacimleri toplamak için ddMS2 izleme moduyla birleştirildi. MS parametreleri şu şekilde ayarlandı: püskürtme voltajı +3,8 kV/- 3,2 kV, kılcal sıcaklık 320°C, koruyucu gaz 40 arb, yardımcı gaz 10 arb, prob ısıtıcı sıcaklığı 350°C, tarama aralığı 70–1050 m/sa, çözünürlük 70.000. Veriler Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific) kullanılarak elde edildi.
Veri kalitesini değerlendirmek için, her örnekten süpernatanttan 10 μL'lik kısımlar alınarak havuzlanmış kalite kontrol (QC) örnekleri oluşturuldu. UPLC-MS sisteminin stabilitesini değerlendirmek için analitik dizinin başında altı kalite kontrol örneği enjeksiyonu analiz edildi. Daha sonra kalite kontrol örnekleri periyodik olarak partiye eklendi. Bu çalışmadaki 11 serum örneği partisinin tamamı LC-MS ile analiz edildi. Ekstraksiyon sürecini izlemek ve partiler arası etkileri ayarlamak için ilgili partilerde referans materyal olarak 100 sağlıklı donörden alınan bir serum havuz karışımının kısımları kullanıldı. Keşif kohortu, iç doğrulama kohortu ve dış doğrulama kohortunun hedeflenmemiş metabolomik analizi, Sun Yat-sen Üniversitesi Metabolomik Merkezi'nde gerçekleştirildi. Sınıflandırıcı modelinin performansını test etmek için Guangdong Teknoloji Üniversitesi Analiz ve Test Merkezi'nin dış laboratuvarı da dış kohorttan 40 örneği analiz etti.
Ekstraksiyon ve yeniden çözündürme işleminden sonra, serum metabolitlerinin mutlak kantifikasyonu, çoklu reaksiyon izleme (MRM) modunda elektrospray iyonizasyon (ESI) kaynağına sahip ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisi-tandem kütle spektrometresi (Agilent 6495 üçlü dörtlü) kullanılarak ölçüldü. Metabolitleri ayırmak için bir ACQUITY BEH Amide kolonu (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters) kullanıldı. Hareketli faz, 10 mmol/L amonyum asetat ve %0,1 amonyak çözeltisi ile %90 (A) ve %5 asetonitril (B)'den oluşuyordu. Gradyan programı şu şekildeydi: 0–1,5 dk, %0 B; 1,5–6,5 dk, %0–15 B; 6,5–8 dk, %15 B; 8–8,5 dk, %15–%0 B; 8,5–11,5 dk, %0 B. Kolon 40 °C'de, numune ise otomatik numuneleyicide 10 °C'de tutuldu. Akış hızı 0,3 mL/dk ve enjeksiyon hacmi 1 μL idi. MS parametreleri şu şekilde ayarlandı: kılcal voltaj ±3,5 kV, püskürtme basıncı 35 psi, kılıf gazı akışı 12 L/dk, kılıf gazı sıcaklığı 350°C, kurutma gazı sıcaklığı 250°C ve kurutma gazı akışı 14 l/dk. Triptofan, piruvat, laktat, hipoksantin ve ksantinin MRM dönüşümleri sırasıyla 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 ve 151,0–107,9 idi. Veriler Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies) kullanılarak toplandı. Serum örnekleri için triptofan, piruvat, laktat, hipoksantin ve ksantin, standart karışım çözeltilerinin kalibrasyon eğrileri kullanılarak ölçüldü. Hücre örnekleri için triptofan içeriği, iç standart ve hücre protein kütlesine göre normalize edildi.
Pik ekstraksiyonu (m/z ve tutunma süresi (RT)) Compound Discovery 3.1 ve TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific) kullanılarak gerçekleştirildi. Partiler arasındaki potansiyel farklılıkları ortadan kaldırmak için, test örneğinin her bir karakteristik piki, aynı partiden referans materyalin karakteristik pikine bölünerek göreceli bolluk elde edildi. Standardizasyondan önce ve sonra iç standartların göreceli standart sapmaları Ek Tablo 6'da gösterilmiştir. İki grup arasındaki farklılıklar, yanlış keşif oranı (FDR<0,05, Wilcoxon işaretli sıralama testi) ve kat değişim (>1,2 veya <0,83) ile karakterize edildi. Çıkarılan özelliklerin ham MS verileri ve referans serum düzeltilmiş MS verileri sırasıyla Ek Veri 1 ve Ek Veri 2'de gösterilmiştir. Pik açıklaması, tanımlanmış metabolitler, varsayımsal olarak açıklanmış bileşikler, varsayımsal olarak karakterize edilmiş bileşik sınıfları ve bilinmeyen bileşikler 22 dahil olmak üzere dört tanımlanmış tanımlama düzeyine göre gerçekleştirildi. Compound Discovery 3.1'deki (mzCloud, HMDB, Chemspider) veritabanı aramalarına dayanarak, MS/MS eşleşmesi doğrulanmış standartlara veya mzCloud'da (skor > 85) veya Chemspider'da tam eşleşme açıklamalarına sahip biyolojik bileşikler, diferansiyel metabolom arasında ara ürünler olarak seçildi. Her özellik için tepe noktası açıklamaları Ek Veri 3'te yer almaktadır. MetaboAnalyst 5.0, toplam normalleştirilmiş metabolit bolluğunun tek değişkenli analizi için kullanıldı. MetaboAnalyst 5.0 ayrıca, anlamlı derecede farklı metabolitlere dayalı KEGG yol zenginleştirme analizini de değerlendirdi. Ana bileşen analizi (PCA) ve kısmi en küçük kareler ayırıcı analizi (PLS-DA), yığın normalleştirme ve otomatik ölçeklendirme ile ropls yazılım paketi (v.1.26.4) kullanılarak analiz edildi. Nodül malignitesini tahmin etmek için en uygun metabolit biyobelirteç modeli, en az mutlak büzülme ve seçim operatörü (LASSO, R paketi v.4.1-3) ile ikili lojistik regresyon kullanılarak oluşturulmuştur. Ayırt edici modelin tespit ve doğrulama setlerindeki performansı, pROC paketi (v.1.18.0.) uyarınca ROC analizine dayalı AUC tahmini ile karakterize edilmiştir. En uygun olasılık kesme noktası, modelin maksimum Youden indeksine (duyarlılık + özgüllük – 1) dayanarak elde edilmiştir. Eşik değerinden daha düşük veya daha yüksek değerlere sahip örnekler sırasıyla benign nodül ve akciğer adenokarsinomu olarak tahmin edilecektir.
A549 hücreleri (#CCL-185, American Type Culture Collection), %10 FBS içeren F-12K ortamında yetiştirildi. SLC7A5'i hedefleyen kısa saç tokası RNA (shRNA) dizileri ve hedeflemeyen bir kontrol (NC), lentiviral vektör pLKO.1-puro'ya yerleştirildi. shSLC7A5'in antisens dizileri şu şekildedir: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). SLC7A5 (#5347) ve tubulin (#2148) antikorları Cell Signaling Technology'den satın alındı. SLC7A5 ve tubulin antikorları, Western blot analizi için 1:1000 oranında seyreltilerek kullanıldı.
Seahorse XF Glikolitik Stres Testi, hücre dışı asitleşme (ECAR) seviyelerini ölçer. Bu testte, ECAR ile ölçülen hücresel glikolitik kapasiteyi test etmek için sırasıyla glikoz, oligomisin A ve 2-DG uygulanmıştır.
Hedefsiz kontrol (NC) ve shSLC7A5 (Sh1, Sh2) ile transfekte edilmiş A549 hücreleri, 10 cm çaplı petri kaplarına bir gece boyunca ekildi. Hücre metabolitleri, 1 ml buz gibi soğuk %80'lik sulu metanol ile ekstrakte edildi. Metanol çözeltisindeki hücreler kazınarak yeni bir tüpe alındı ve 4°C'de 15 dakika boyunca 15.000 × g'de santrifüjlendi. 800 µl süpernatant toplandı ve yüksek hızlı vakum konsantratörü kullanılarak kurutuldu. Kurutulmuş metabolit peletleri daha sonra yukarıda açıklandığı gibi LC-MS/MS kullanılarak triptofan seviyeleri açısından analiz edildi. A549 hücrelerindeki (NC ve shSLC7A5) hücresel NAD(H) seviyeleri, üreticinin talimatlarına göre kantitatif bir NAD+/NADH kolorimetrik kiti (#K337, BioVision) kullanılarak ölçüldü. Metabolit miktarını normalleştirmek için her örnek için protein seviyeleri ölçüldü.
Örneklem büyüklüğünü önceden belirlemek için istatistiksel yöntemler kullanılmamıştır. Biyobelirteç keşfine yönelik önceki metabolomik çalışmalar15,18, büyüklük belirleme için referans olarak kabul edilmiş ve bu raporlarla karşılaştırıldığında, örneklemimiz yeterli bulunmuştur. Çalışma kohortundan hiçbir örnek dışlanmamıştır. Serum örnekleri, hedeflenmemiş metabolomik çalışmalar için rastgele bir keşif grubuna (306 vaka, %74,6) ve bir iç doğrulama grubuna (104 vaka, %25,4) atanmıştır. Ayrıca, hedeflenmiş metabolomik çalışmalar için keşif setinden her gruptan rastgele 70 vaka seçilmiştir. Araştırmacılar, LC-MS veri toplama ve analiz sırasında grup atamasına karşı körleştirilmiştir. Metabolomik verilerin ve hücre deneylerinin istatistiksel analizleri, ilgili Sonuçlar, Şekil Açıklamaları ve Yöntemler bölümlerinde açıklanmıştır. Hücresel triptofan, NADT ve glikolitik aktivitenin kantifikasyonu, aynı sonuçlarla üç kez bağımsız olarak gerçekleştirilmiştir.
Çalışma tasarımına ilişkin daha fazla bilgi için, bu makaleyle birlikte verilen Doğal Portföy Raporu Özetine bakınız.
Çıkarılan özelliklerin ham MS verileri ve referans serumun normalize edilmiş MS verileri sırasıyla Ek Veri 1 ve Ek Veri 2'de gösterilmiştir. Diferansiyel özellikler için tepe noktası açıklamaları Ek Veri 3'te sunulmuştur. LUAD TCGA veri seti https://portal.gdc.cancer.gov/ adresinden indirilebilir. Grafiğin çizimi için giriş verileri kaynak verilerde sağlanmıştır. Bu makale için kaynak veriler sağlanmıştır.
Ulusal Akciğer Tarama Çalışma Grubu, vb. Düşük dozlu bilgisayarlı tomografi ile akciğer kanseri mortalitesinin azaltılması. Kuzey İngiltere. J. Med. 365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR ve Prophet, PC Akciğer kanseri taraması için düşük dozlu helisel BT kullanımı: Ulusal Akciğer Tarama Çalışması'ndan (NLST) elde edilen sonuçlar. J. Med. Screen 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ, ve diğerleri. Rastgeleleştirilmiş bir çalışmada hacimsel BT taraması ile akciğer kanseri mortalitesinin azaltılması. Kuzey İngiltere. J. Med. 382, 503–513 (2020).
Yayın tarihi: 18 Eylül 2023