Kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR), yüksek verimlilik sonuçlarıyla dünyayı devrimleştiren üçüncü nesil bir genom düzenleme tekniğidir. Çeşitli biyolojik hastalıkların ve enfeksiyonların tedavisinde kullanılmıştır. Çeşitli bakteriler ve diğer prokaryotlar (örneğin arkealar) da fajlara karşı savunma için CRISPR/Cas9 sistemlerine sahiptir. CRISPR/Cas9 tabanlı stratejilerin, potansiyel olarak değiştirilmiş direnç genlerini, transkripsiyonu ve epigenetik düzenlemeyi hedefleyerek üçlü negatif meme kanserinin (TNBC) büyümesini ve ilerlemesini engelleyebileceği bildirilmiştir. Bu terapötik müdahaleler, TNBC'de bile gözlemlenen ilaç direnci gibi zorlu sorunların ele alınmasına yardımcı olabilir. Şu anda, CRISPR/Cas9'u hedef hücrelere iletmek için fiziksel (mikroenjeksiyon, elektroporasyon ve hidrodinamik modlar), viral (adeno-ilişkili virüs ve lentivirüs) ve viral olmayan (lipozomlar ve lipid nanopartiküller) gibi çeşitli yöntemler kullanılmaktadır. TNBC'nin moleküler nedenlerini incelemek için çeşitli modeller geliştirilmiş olmasına rağmen, genom düzenleme araçlarının in vivo olarak uygulanmasına yönelik hassas ve hedefli yöntemlerin eksikliği, bunların klinik uygulamalarını sınırlamaktadır. Özetle, bu inceleme, mevcut kanıtlara dayanarak TNBC için CRISPR/Cas9 tedavisinin ilerlemesini, zorluklarını, sınırlamalarını ve gelecek beklentilerini kapsamlı bir şekilde ele almaktadır. Ayrıca, yapay zeka ve makine öğreniminin birleşiminin TNBC tedavisinde CRISPR/Cas9 stratejilerini nasıl geliştirebileceğini de vurguluyoruz.
Kanser, kontrolsüz hücre bölünmesi, hücre döngüsü kontrol noktalarının bozulması ve tümör baskılayıcı genlerde (TSG'ler) mutasyonlarla karakterize edilir (Matthews vd., 2022). Farklı kanser türleri arasında meme kanseri, kadınlarda en sık görülen kanser türüdür ve dünya çapında yüksek bir ölüm oranına sahiptir (Waks ve Winer, 2019). Meme kanseri, histolojik ve biyolojik özellikler, klinik sunum ve davranış ile tedaviye yanıt gibi çeşitli özelliklere sahip heterojen bir hastalıktır (Weigelt vd., 2010). Meme kanseri sınıflandırması, meme kanseri tanısı ve tümör prognozu için kesin bilgiler sağlar. Yaygın biyobelirteçlerin ve klinikopatolojik özelliklerin kullanımı, meme kanseri sınıflandırmasının ana kriteri olmuştur (Tsang ve Tse, 2019). Meme kanserinin prognozu ve tedaviye yanıtı, östrojen reseptörü (ER), progesteron reseptörü (PR), insan epidermal büyüme faktörü reseptörü 2 (HER2/neu) varlığı, histolojik derece, tümör tipi, boyutu ve lenf düğümü metastazı dahil olmak üzere birçok faktörden etkilenir (Al-Tubaiti, 2020). Meme kanserinin beş içsel moleküler alt tipi tanımlanmıştır: luminal A, luminal B, HER2-zenginleştirilmiş, bazal benzeri ve klaudin-düşük (Prat vd., 2015). TNBC, tüm ER, PR ve HER2'yi ifade etmeyen bir kanser moleküler alt tipidir (Yin vd., 2020). Bu patolojik özellikler TNBC ile ilişkilidir ve diğer meme kanseri türlerine göre daha hızlı ilerlemesini ve daha agresif doğasını doğrular (Feng vd., 2018). Ayrıca, Peru ve ark. (2000), meme kanserini yeniden sınıflandırmak ve meme kanserinin beş içsel alt tipini belirlemek için mikrodizi teknolojisini kullandı (Cadenas, 2012). Bazal benzeri meme kanseri, üçlü negatif fenotipe sahip ve hızlı ilerlemeyle ilişkili bir meme kanseri alt tipidir. Tüm bazal benzeri meme kanserlerinin sıklıkla TNBC olarak yanlış teşhis edildiği, ancak yalnızca %77'sinin TNBC olduğu belirtilmelidir; buna karşılık, TNBC'nin %71-91'i bazal benzeridir, bu da bu iki meme kanseri türünün örtüştüğünü ve farklı sınıflandırmaları temsil ettiğini göstermektedir (Wang D.-Y. ve ark., 2019). Bu durum, prognozu aydınlatmak ve mevcut ve gelecekteki tedavilere potansiyel yanıtları belirlemek için TNBC'nin heterojenliğini karakterize etme ihtiyacını doğurmaktadır. Ayrıca, TNBC tüm meme kanseri vakalarının %15-20'sini oluşturur ve 50 yaşın altındaki kadınlarda daha yaygındır. BRCA1 veya BRCA2 mutasyonlarının TNBC vakalarının yaklaşık %20'sinde rapor edildiği bildirilmiştir (Xie vd., 2017; Tzikas vd., 2017, 2020). Çalışmalar ayrıca TNBC'nin, yüksek düzeyde vasküler endotelyal büyüme faktörleri, tümörle ilişkili makrofajlar (TAM'lar), tümör içine sızan lenfositler (TIL'ler) ve tümör büyümesi ve göçünde rol oynayan diğer molekülleri içeren farklı bir immün mikroortama sahip olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, TNBC'nin mikroortamını anlamak, prognozu ve tedavisi için kritik öneme sahiptir (Fan ve He, 2022).
TNBC'nin prognozunu değerlendirmek ve etkili tedavi sağlamak için, esas olarak ER, PR ve HER2'yi tespit etmek için immünohistokimya (IHC) ve meme neoplazmlarını tespit etmek için mamografiye dayalı doğru tanı önemlidir. Bununla birlikte, mamografi nekroz ve fibroz gibi tümör içi özellikleri yeterince gösteremez (Deepak Singh vd., 2021). Kötü prognoz ve tanı, doktorların doğru ilaçları reçete etmesini engellediğinden (Chaudhary, 2020), TNBC'li hastaların bakımını iyileştirmek için çeşitli stratejiler kullanılmaktadır. Şu anda, TNBC'li hastalarda doxorubicin ve siklofosfamid olmak üzere iki ilaç kullanılmakta ve iyi sonuçlar göstermektedir. Buna ek olarak, karboplatin ve cisplatin gibi diğer platin ilaçları da kullanılmaktadır (Sikov vd., 2015). Ek olarak, Olaparib, Velaparib ve PF-01367338 gibi PARP inhibitörleri, TNBC tedavisinde potansiyel kemoterapi ilaçları olarak kullanılmıştır (Ishino vd., 2018). Wnt/b-Katenin, NOTCH ve Hedgehog sinyal yollarının TNBC'nin oluşumunda ve ilerlemesinde rol oynadığı bildirildiğinden, bu yollara yönelik ilaçların hedeflenmesi önemli bir strateji olabilir (Aysola vd., 2013). Cerrahi, radyoterapi ve kemoterapi günümüzde TNBC tedavisinin temelini oluşturmaya devam etse de, hedefli tedavi, immünoterapi, Cas9n, dCas9, CRISPR/Cas12, prime düzenleme ve CRISPR/Cas9 hedefli gen terapisi gibi çeşitli CRISPR ile ilgili gen düzenleme araçları da dahil olmak üzere yeni tedavilerin geliştirilmesinde önemli ilerlemeler kaydedilmiştir. Burada, TNBC tedavisinde kullanılan çeşitli CRISPR ile ilgili gen düzenleme araçlarına odaklanacağız. Bunlar arasında CRISPR/Cas9 geniş yankı uyandırdı.
Cas9n, diğer adıyla Cas9 nikaz, CRISPR/Cas9 genom düzenleme sisteminden türetilen Cas9 proteininin genetik olarak tasarlanmış bir varyantıdır (Gupta vd., 2019). Orijinal formunda, Cas9 proteini iki nükleaz alanı içerir: RuvC ve HNH; bunların ana işlevi her iki DNA ipliğinin de kesilmesidir. Bununla birlikte, Cas9n'de, nükleaz alanlarından biri olan HNH genetik olarak mutasyona uğrar ve inaktif hale gelir. Bu nedenle, Cas9n'nin HNH alanı işlevsiz kalır. Sadece RuvC alanı aktif kalır ve Cas9n'nin tek DNA ipliklerinde kesme veya kırılma oluşturmasına olanak tanır (Trevino ve Zhang, 2014). Cas9 ile karşılaştırıldığında, Cas9n hedef dışı etkileri etkili bir şekilde azaltabilir ve hücre onarım mekanizmalarını doğru bir şekilde iyileştirebilir. Cas9n, çift sarmallı DNA'da belirli yerlerde kırılma oluşturmak gibi çeşitli sorunları çözmek için kullanılabilir. Bu amaçla iki Cas9n molekülü birleştirilerek birlikte kullanıldı (Yee, 2016). Karışık soy kinaz 3 (MLK3), TNBC metastazı sırasında önemli bir düzenleyici görevi gören mitojenle aktive olan bir protein kinazdır (Cronan vd., 2012).
MLK3, TNBC metastazına yol açan birden fazla sinyal yolunu aktive edebilir. Örneğin, c-Jun N-terminal kinaz (JNK) yolu hücre hareketliliğini ve hücre dışı matris yıkımını düzenler ve MLK3, JNK yolunu aktive ederek hücre hareketliliğini artırır ve invaziv özellikler kazandırır (Rattanasinchai ve Gallo, 2016). MLK3 ayrıca EMT'yi de düzenler. Bunu yapmak için, Snail, Slug ve Twist gibi aşağı akış transkripsiyon faktörlerini aktive eder. Bu faktörler, epitel belirteçlerinin ekspresyonunu inhibe eder ve mezenkimal belirteçlerin ekspresyonunu teşvik ederek metastatik bir fenotipin kazanılmasına yol açar (Casalino vd., 2023). MLK3'ün, ECM yeniden şekillenmesinde ve ECM'yi parçalayan matris metalloproteinazlar (MMP'ler) gibi proteazların aktivasyonunda rol oynadığı gözlemlenmiştir. Bu durum, tümör hücrelerinin istilasına ve uzak bölgelere yayılmasına olanak sağlar (Katari vd., 2019). Dolayısıyla, önceki çalışmalar MLK3'ün TNBC'de kritik bir rol oynadığını göstermiştir. Rattanasinchai ve Gallo, MLK3'ün rolünü incelemek için TNBC modelleri kullandılar ve belirli sinyal yolları aracılığıyla kanser gelişimini desteklediğini buldular. MLK3'ü düzenlemek için CRISPR/Cas9n kullandılar ve TNBC metastazında önemli bir azalma gözlemlediler (Rattanasinchai ve Gallo, 2016).
Sıklıkla inaktif Cas9 olarak adlandırılan dCas9, Cas9 proteininin modifiye edilmiş bir türevidir. Aktif Cas9'dan farklı olarak, dCas9 endonükleaz aktivitesine sahip değildir ve bu nedenle DNA çift sarmal kırılmalarına neden olamaz. Bu nedenle, dCas9, DNA dizisinde herhangi bir değişiklik veya modifikasyon olmaksızın genomun belirli bölgelerini hassas bir şekilde hedeflemek için kullanılabilir (Wang vd., 2016). dCas9'da, iki endonükleaz proteini olan RuvC ve HNH, önemli amino asit kalıntılarını baskılayarak inaktive edilir (Richter vd., 2016). DNA kesme aktivitesinin olmamasına rağmen, dCas9 genetik araştırma ve biyoteknolojide bir dizi önemli rol oynar. Örneğin, genomun belirli bölgelerinin görselleştirilmesine olanak tanır, transkripsiyonel düzenlemeyi kolaylaştırır ve epigenetik modifikasyonları teşvik eder (Brocken vd., 2018).
Transkripsiyon faktörü ZEB1 (çinko parmak E-kutusu bağlayıcı homeobox 1), embriyonik gelişim, doku onarımı ve kanser ilerlemesi sırasında meydana gelen hücresel bir süreç olan epitel-mezenkimal geçişin (EMT) aracılığında spesifik ve kritik bir rol oynar. Bu süreç, epitel hücrelerinin mezenkimal hücrelere dönüşümünü içerir ve hücre morfolojisi, hareketliliği, invazivliği vb. değişikliklere yol açar (Wu vd., 2020). ZEB1, TNBC'de epitel hücrelerinin hücreler arası yapışmasını ve polaritesini korumaktan sorumlu olan E-kadherin ve okludin gibi birden fazla epitel belirtecini inhibe eder (Moreno-Bueno vd., 2008). Ek olarak, ZEB1, N-cadherin, vimentin ve fibronectin gibi belirli belirteçleri aktive eder (Konradi vd., 2014) ve ayrıca Rho GTPazlar ve matriks metalloproteinazlar (MMP'ler) gibi sitoskeletal yeniden yapılanmada yer alan genleri düzenler (Huang vd., 2014). Ayrıca, dönüştürücü büyüme faktörü-β (TGF-β), Wnt sinyallemesi vb. gibi çeşitli sinyal yollarını da etkileyerek TNBC'de tümör istilasını ve metastazı teşvik eder (Chen vd., 2016). Çok sayıda çalışma ve bilimsel kanıt, ZEB1'in TNBC'nin tespiti ve terapötik müdahalesi için değerli bir ajan olarak büyük potansiyele sahip olduğunu göstermektedir. Yakın tarihli bir çalışmada, Waryah vd., bir TNBC modeli kullanarak dCas9 ile ZEB1'in tamamen baskılanmasını sağlamıştır. Bu nedenle, in vivo koşullarda ZEB1'in çok yüksek özgüllüğünü ve neredeyse tamamen inhibisyonunu gözlemlediler (Waryah ve ark., 2023).
CRISPR/Cas12, CRISPR/Cpf1 olarak adlandırılan bir gen düzenleme aracıdır. CRISPR/Cas sisteminden türetilmiştir ve Cas12 terimi, CRISPR ile ilişkili protein 12'yi (Bharathkumar vd., 2022) ifade eder; bu da Cas9 ile tamamen aynıdır. Tek fark, Cas12 proteinini içermesidir. Cas9 ile karşılaştırıldığında, Cas12'nin gen düzenleme sürecinde yapışkan uçlar oluşturması gibi bazı benzersiz işlevleri vardır, oysa Cas9 künt uçlar oluşturur (Wang vd., 2021). Cas12'nin bu özelliği, spesifik DNA manipülasyon teknolojisine katkıda bulunur. Hedef DNA'yı hassas bir şekilde tanıma ve kesme yeteneğine sahip bir protein olarak, olağanüstü çok yönlülüğe sahiptir ve gen düzenleme de dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için etkili bir araçtır (Pickar-Oliver ve Gersbach, 2019).
Diğer CRISPR varyantlarına benzer şekilde, CRISPR/Cas12 de TNBC'de genleri devre dışı bırakma veya aktive etme yeteneğine sahiptir ve patogenezinde veya tedaviye yanıtında önemli rol oynayan genleri hedef alır (Yang ve Zhang, 2023). Bu işlemi gerçekleştirmek için, Cas12'yi hedef gene yönlendiren bir kılavuz RNA (gRNA) geliştirilmiştir. Cas12 hedefine bağlandığında, DNA'da çift zincir kırılmaları oluşturur ve DNA onarım mekanizmalarını aktive eder. Onarım sürecinde, yanlış nükleotidler eklenebilir, bu da gen mutasyonlarına ve fonksiyon kaybına yol açabilir (Zhang vd., 2021a). Ek olarak, genleri aktive etmek için Cas12 enziminin geliştirilmiş bir versiyonu (dCas12 olarak adlandırılır) da kullanılmıştır. Bunu bir transkripsiyon aktivatörü ile birleştirerek, belirli genleri indüklemek ve böylece aktive etmek mümkündür. Bu teknoloji, tümör baskılayıcı genlerin aktivasyonunu teşvik etmede büyük bir potansiyele sahiptir (Sultan vd., 2022).
Prime düzenleme, yeni geliştirilmiş ve son derece üstün bir genom düzenleme teknolojisidir. Bir organizmanın DNA'sını çok hassas bir şekilde değiştirebilme yeteneğine sahiptir (Chen ve Liu, 2023). Prime düzenleme, iki ana bileşenin entegrasyonuyla gerçekleştirilir: modifiye edilmiş bir CRISPR/Cas9 enzimi ve ters transkriptaz. CRISPR/Cas9 enziminin rolü, genomdaki belirli bölgeleri seçici olarak hedeflemektir, ters transkriptaz ise hedef konumdaki DNA'yı kapsamlı bir şekilde değiştirmeye yardımcı olur (Hassan vd., 2021). Prime düzenleme mekanizmasında, ilk adım bir primer düzenleme kılavuz RNA'sı (pegRNA) oluşturmayı içerir (Standage-Beier vd., 2021). Bu, hedef DNA'daki istenen düzenleme bölgesine karşılık gelen hedef diziyi ve RNA şablonunu içerir. Daha sonra pegRNA, bir primer düzenleme nükleazı (PE2) ile birlikte hedef hücrelere verilir. PE2, bir Cas9 enzimi, bir ters transkriptaz ve bir primer düzenleme adaptöründen oluşan bir füzyon proteinidir (Martín-Alonso vd., 2021). Hücre içinde, pegRNA ve PE2 kompleksleri, değiştirmek istedikleri spesifik DNA'yı ararlar. Cas9 enzimi DNA'yı keser ve tek zincirlerden oluşan bir şablon oluşturur (Choi vd., 2022). Ters transkriptaz, DNA'yı düzenleme için hazırlamak üzere bu şablonu kullanır. DNA kopyalamanın yanı sıra, RNA şablonunu düzenleme talimatları da eklenir. Son olarak, yeni oluşturulan DNA zinciri, DNA'daki kırılmayı onarmak için şablon olarak kullanılır ve istenen modifikasyonu içeren değiştirilmiş bir DNA dizisi elde edilir (Ochoa-Sanchez vd., 2021). Primer düzenleme mekanizmaları, genlerde yaygın mutasyonlara yol açabilir. Nokta mutasyonlarını, eklemeleri, silmeleri ve hatta gen değişimlerini hedefleyebilir (Anzalone vd., 2019; Chen ve Liu, 2023). Primer düzenleme, önceki genom düzenleme teknolojilerine göre çeşitli avantajlar sunmaktadır. Bunlar arasında artan doğruluk, azaltılmış hedef dışı etkiler ve DNA çift sarmal kırılmalarına dayanmadan DNA'yı düzenleme yeteneği yer almaktadır (Anzalone ve ark., 2020).
CRISPR/Cas9 teknolojisi başlangıçta bakterileri plazmit transferinden ve faj enfeksiyonundan korumak için geliştirilmiş ve daha sonra genom düzenleme için etkili bir RNA tabanlı DNA hedefleme aracı olarak yeniden kullanılmıştır (Jiang ve Doudna, 2017). Ayrıca, CRISPR/Cas9 sisteminin sırasıyla bakteri ve arkeal genomların %50 ve %87'sinde bulunduğu bildirilmiştir (Ishino vd., 2018). CRISPR/Cas9, in vivo ve in vitro modlarda herhangi bir anormal genetik dizinin silinmesi, eklenmesi ve düzeltilmesi için potansiyel bir araçtır (Sabrifette vd., 2021). Dahası, CRISPR/Cas9'un, hedef genlere özgüllüğü nedeniyle adaptif bağışıklık sisteminin bir parçası olduğu gösterilmiştir (Chen ve Zhang, 2018).
CRISPR/Cas9, Cas9 ve tek bir kılavuz RNA'dan (sgRNA) oluşur. Cas9, birden fazla protein bileşeninden oluşan bir endonükleazdır. Ayrıca, Cas9, iki lobdan oluştuğu için benzersiz yapısal ve konformasyonel özelliklere sahiptir (Pacesa vd., 2022): tanıma (REC) ve nükleaz (NUC). REC lobu ayrıca üç bölgeye ayrılır: REC1, REC2 ve köprü sarmalları (Cromwell vd., 2018). NUC, RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH ve protospacer bitişik motif (PAM) etkileşim alanı olmak üzere üç lobdan oluşur (Şekil 1) (Song vd., 2016). sgRNA, CRISPR RNA (crRNA) ve transkodlayıcı küçük RNA (izleyici RNA) olmak üzere iki bileşenden oluşur (Şekil 1). sgRNA, Cas9 proteinini konneksinlere bağlayarak aktif bir kompleks, yani efektör kompleksi oluşturur (Richter vd., 2012). crRNA, hedef DNA dizilerini tanımada kritik bir rol oynayan 18-20 nükleotitlik bir baz çiftidir. Ek olarak, crRNA hedef DNA ile eşleşir ve tracrRNA, Cas9 nükleazının hedef DNA'ya bağlanması için bir iskele görevi görür (Manghwar vd., 2019). Öte yandan, PAM dizisi 3 nükleotitten oluşur ve efektör kompleksinin DNA'ya bağlanmasını doğrular, belirler ve aracılık eder. Cas9 protein kompleksinin alt birimleri RuvC ve HNH katalitik aktiviteye sahiptir (Richter vd., 2012; Asmamaw ve Zawdie, 2021). Cas9 alt biriminin HNH nükleaz alanı, crRNA ile ilişkili DNA zincirini keser. RuvC nükleaz alanı diğer DNA zincirlerini keser ve çift zincir kırılmaları (DSB'ler) oluşturur; bunun ardından iki farklı DNA kırılma onarım mekanizması aktive olur (Jiang ve Doudna, 2017) (Şekil 1).
Şekil 1. CRISPR/Cas9'a Genel Bakış (A). CRISPR/Cas9 sisteminin bileşenleri: (i). Cas9 endonükleazı hedef DNA dizisini kesmekten sorumludur, (ii) crRNA ve tra-crRNA kimeralarının füzyonundan oluşan tek bir kılavuz (sg) RNA. (iki). Cas9, Rec I, Rec II, NUC lobu (HNH ve Ruv C alt bileşenlerdir) ve PAM etkileşim alanı (C) gibi çeşitli bileşenleri ve bunlara karşılık gelen işlevleri içerir. CRISPR/Cas9 protein kompleksi, DNA dizilerini tamamlayıcı olmayan ve tamamlayıcı formlara ayırır (D). CRISPR/Cas9, genomu üç aşamada düzenler: tanıma, kesme ve onarım. Tasarlanan sg-RNA, Cas9'u yönlendirir ve tamamlayıcı bileşen crRNA aracılığıyla istenen diziyi tanır. Cas9, 5′-NGG-3′'deki PAM dizisini tanır ve DNA'yı eriterek bir DNA-RNA hibriti oluşturur ve kesmeyi aktive eder. Cas9'un HNH alanı tamamlayıcı ipliği, RuvC alanı ise tamamlayıcı olmayan ipliği keser. CRISPR/Cas9, çift sarmallı DNA'yı iki şekilde kırarak onarır: homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) ve homolog yönlendirmeli onarım (HDR). NHEJ, yabancı homolog DNA'nın yokluğunda enzimatik bir işlem yoluyla çift sarmallı DNA'yı onarır; bu, rastgele DNA dizileri ekleyebilen veya çıkarabilen hataya yatkın bir mekanizmadır. HDR çok spesifiktir ve homolog DNA şablonları gerektirir.
CRISPR/Cas9 aracılı onarım yolları, homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) ve homolog yönlendirmeli onarım (HDR) mekanizmalarını içerir. NHEJ, ekleme veya silme içerdiği ve onarım mekanizması sırasında herhangi bir kalıba ihtiyaç duymadığı için hataya yatkın bir yoldur. Standart proteinler üretmek için rastgele nükleotidler kullanır (Abbasi vd., 2021). Bu onarım sistemi, KU kompleksi, çapraz tamamlayıcı protein kompleksi tip 4 (XRCC-4), DNA uç işleme enzimi ve protein kinaz DNA-PKcs gibi dört kompleksten oluşur (Abbasi vd., 2021). KU kompleks proteini, Ku 70 ve Ku 80 olmak üzere iki alt birime sahiptir ve NHEJ mekanizmasında önemli bir rol oynar, çünkü onarım mekanizması, iki alt birimin (Ku 70 ve Ku 80) hedef DNA'nın künt veya neredeyse künt uçlarına bağlanmasıyla başlatılır (Abbasi vd., 2021), diğer NHEJ ile ilgili faktörleri hasar bölgesine çekmek için bir iskele görevi görür (Yang vd., 2020). XRCC-4 ve DNA ligaz sırasıyla 334 ve 911 amino asitten oluşur ve XRCC4-DNA ligaz IV kompleksi DNA uçlarının ligasyonunu uyarır (Chatterjee vd., 2015). Polinükleotid kinaz 3'-fosfat olarak da bilinen DNA uç işleme enzimi, bir DNA uç işleme enzimidir. DNA'daki 3'P grubunu çıkarabilir ve DSB onarımı sırasında 5'OH grubunu fosforlayabilir. Ayrıca, tek zincirli kırılmaların (SSB) onarım yolunu kullanarak SSB'lerin onarımını da içerir (Chatterjee vd., 2015). Protein kinaz DNA-PKcs, PIKK'lerin (fosfatidilinositol 3-kinaz ile ilişkili kinazlar) ve ataksi telanjiektazi mutasyonu (ATM) ailesinin katalitik bir alt biriminden ve ayrıca ATM ve Rad3 ile ilişkili ATR'lerden oluşan DNA'ya bağımlı bir protein kinazdır. Çift zincirli kırılmalar (DSB) ve tek zincirli kırılmalar (Yue vd., 2020; Peng vd., 2016).
HDR, homolog DNA çift sarmalının bozulmamış formu kullanılarak bilginin kopyalanması nedeniyle daha doğru ve uygun bir onarım mekanizmasıdır, ancak kardeş kromatidlerin varlığını gerektirir. Bu, memeli hücre döngüsünün S/G2 fazında gerçekleşir. HDR esas olarak maya türlerinde görülür, ancak NHEJ memelilerde kritik öneme sahiptir (Burma vd., 2006; Abbasi vd., 2021). Tam onarım mekanizması Şekil 1'de gösterilmiştir.
TNBC genetik ve epigenetik anormalliklerden kaynaklandığı için, CRISPR/Cas9 kullanılarak malign genomik/epigenomik anormalliklerin düzeltilmesi makul bir tedavi yaklaşımı olabilir (Chen vd., 2019). Ek olarak, hücreye özgü transkripsiyonel düzenlemede yer alan bazı transkripsiyon faktörleri, kanser hücrelerinin benzersiz özelliklerini sergileyebilir; bu da transkripsiyonel düzenlemenin kanser tedavisi için mükemmel bir yaklaşım olabileceğini düşündürmektedir (Drost vd., 2017). Genetik, epigenetik ve transkripsiyonel kusurlar gibi tümörlerin bu moleküler özelliklerinden ilaç geliştirme için yararlanmak, klinik sonuçları iyileştirebilir ve tarama maliyetlerini azaltabilir. CRISPR, yalnızca kansere neden olan genomik hedefleri tespit edip tanımlamakla kalmayıp, aynı zamanda insan hücrelerinde onkogenleri düzenlemek, baskılamak ve epigenetik olarak değiştirmek için de kullanılabilen potansiyel bir gen düzenleme aracıdır (Tablo 1) (Ahmed vd., 2021). Tümör baskılayıcılar, onkogenler ve ilaç direnci ile ilişkili genleri aramak için çeşitli CRISPR taramaları yapılmıştır. Şekil 2'de çeşitli TNBC onkogenlerini düzenlemek için CRISPR/Cas9 kullanımına dair bir örnek verilmiştir.
Şekil 2. CRISPR/Cas9 kullanılarak çeşitli TNBC onkogenlerinin gen düzenlemesi, tümör büyümesinin ve metastazın azalmasına yol açmaktadır. Bu onkogenler arasında TNBC'nin oluşumunda ve metastazında rol oynayan CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 ve CXCR7, Crypto1, ROR1 ve ST8SIA yer almaktadır.
Kanser hücresi göçü, istilası ve epitel-mezenkimal geçiş (EMT) ITGA9 ile ilişkilidir. Önceki çalışmalar, ITGA9'un Notch yolunda önemli bir oyuncu olduğunu ve rabdomiyosarkom metastazında ilginç bir rol oynadığını göstermiştir (Molist vd., 2020). Ayrıca, ITGA9'un meme kanseri de dahil olmak üzere çeşitli tümör tiplerinde hasta prognozuyla yakından ilişkili olduğu bulunmuştur (Wang Z. vd., 2019). Ek olarak, ITGA9'un biyoinformatik analizi, TNBC'deki ekspresyonunun diğer meme kanseri alt tiplerine göre önemli ölçüde daha yüksek olduğunu göstermiştir. Yüksek ITGA9 seviyeleri, TNBC hastalarında tümör metastazı ve nüksü ile ilişkilidir. CRISPR/Cas9 ile ITGA9'un nakavt edilmesi, TNBC'de β-katenin yıkımını teşvik ederek kanser kök hücresi (CSC) benzeri özellikler, tümör anjiyogenezi, tümör büyümesi ve metastazın azalmasına yol açmıştır (Wang Z. vd., 2019).
Kripto-1, TGF-β ailesinin bir üyesidir ve erken embriyogenez, kök hücre bakımı ve kanser metastazı için kritik öneme sahiptir (Ishii vd., 2021). Ayrıca Tdgf-1 olarak da bilinen bu protein, ilkel çizgi, mezoderm ve endoderm oluşumunun yanı sıra embriyogenez sırasında vücut organlarının gelişiminde sol/sağ asimetrisinin oluşturulmasında rol oynayan onkojenik bir GPI bağlantılı sinyal proteinidir (Zhang vd., 2021b). Ek olarak, Kripto-1'in bir kök hücre belirteci olarak epitel-mezenkimal geçişte (EMT) rol oynadığı gösterilmiştir (Zhang vd., 2021b). EMT, sadece embriyonik gelişim, fibroz ve yara iyileşmesi gibi çeşitli süreçler için değil, aynı zamanda kanser istilası ve metastazı için de kritik öneme sahiptir. Ek olarak, Crypto-1'in dört Notch reseptörüyle etkileşime girdiği ve bunların translasyon sonrası olgunlaşmasını artırdığı gösterilmiştir (Brandstadter ve Maillard, 2019). Notch sinyal yolunun insan meme kanseri hücrelerinin korunmasında rol oynadığı bilinmektedir. Çalışmalar, CRISPR/Cas9 aracılığıyla Crypto-1'in devre dışı bırakılmasının kanser büyümesini ve metastazı baskıladığını göstermiştir. Bu nedenle, Crypto-1, TNBC için önemli bir terapötik hedef haline gelebilir (Castro vd., 2015).
XCL12 proteini ve kemokin reseptörü CXC (CXCR4 ve CXCR7), kanser hücresi proliferasyonu, büyümesi, göçü ve istilasında çeşitli roller oynar (Wu vd., 2015). Bu kemoreseptörler, hem in vivo hem de in vitro modellerde çoklu sinyal yolları aracılığıyla TNBC gelişimiyle ilişkilendirilmiştir (Wu vd., 2015). Ek olarak, CXCR4 ve CXCR7 aktivasyonu, TNBC'de metastaza daha fazla yatkınlık ve kötü prognoz ile ilişkilidir (Karn vd., 2022). Bu nedenle, CXCR4 ve CXCR7'nin nakavt edilmesi, TNBC de dahil olmak üzere meme kanserinin tedavisi için etkili ilaç hedef genleri haline gelebilir. Yang vd. tarafından yapılan çalışma. Yang ve ark. (2019), CXCR4 ve CXCR7 genlerini eş zamanlı olarak devre dışı bırakmak için CRISPR/Cas9 kullandılar ve TNBC'nin çoğalmasının, büyümesinin, göçünün ve istilasının önemli ölçüde engellendiğini buldular (Yang ve ark., 2019).
TNBC onkogeni olan miR-3662'nin meme kanseri dokularında artmış seviyeleri gözlemlenmiştir (Yi vd., 2022). miR-3662'nin baskılanmasının hem in vivo hem de in vitro olarak meme kanseri tümör büyümesini ve metastazını inhibe ettiği gösterilmiştir (Agarwal ve Gupta, 2021). HBP-1, Wnt/β-katenin sinyalizasyonunun güçlü bir inhibitörüdür ve muhtemelen miR-3662 aracılı TNBC hücre büyümesinden sorumludur. Son zamanlarda Yi vd., miR-3662-HBP1 ekseninin TNBC hücrelerinde Wnt/β-katenin sinyalizasyon yolunu düzenlediğini bulmuştur (Yi vd., 2022). Tümöre özgü ekspresyonu nedeniyle, miR-3662, TNBC için potansiyel bir terapötik hedef olabilir. Bu nedenle, CRISPR/Cas9 aracılı miR-3662 baskılanması, TNBC tedavisi için yeni ilaçlar geliştirmek için mükemmel bir yaklaşım olabilir.
UBR5, çeşitli kanserlerde tümör oluşumu, metastaz ve bağışıklık yanıtının önemli bir düzenleyicisi olarak tanımlanan 300 kDa'lık bir nükleofosfoproteindir (Shearer vd., 2015; Fu vd., 2023). UBR5'in TNBC örneklerinde yüksek oranda yukarı regüle edildiği ve ubiquitin ligaz aktivitesi yoluyla proliferasyonu indükleyerek ERα fonksiyonunu uyardığı bildirilmiştir (Bolt vd., 2015). Primer TNBC örneklerinin tüm ekzom dizileme çalışmaları da UBR5'in artmış ekspresyonunu göstermiş ve TNBC gelişimindeki rolünü öne sürmüştür. Ek olarak, CRISPR/Cas9 ile yönlendirilen UBR5 delesyonu, deneysel fare modellerinde TNBC metastazını ve büyümesini önemli ölçüde inhibe etmiştir. Dahası, vahşi tip fare modeline UBR5'in dahil edilmesi, tam işlevselliğini geri kazandırırken, bu etki inaktive edilmiş mutant suşlarda gözlenmemiştir (Liao vd., 2017). UBR5 eksikliği, zayıf anjiyogenez nedeniyle TNBC'de artmış apoptoz, nekroz ve tümör büyümesinin inhibisyonu ile ilişkilidir. UBR5 kaybı nedeniyle, tümörün uzak organlara yayılımı azalır ve UBR5, esas olarak E-cadherin ekspresyonunu azaltarak anormal EMT'yi indükler (Zhang ve Weinberg, 2018). Son zamanlarda, UBR5'in E3 ubikitinasyon aktivitesinin yokluğu nedeniyle TNBC'de IFN-γ ile indüklenen PDL1 transkripsiyonunda çok önemli bir faktör olduğu gösterilmiştir. RNA transkriptom analizi, UBR5'in IFN-γ yoluyla ilişkili genler üzerinde sistemik etkilere sahip olabileceğini ve protein kinaz RNA (PKR) ve sinyal ileticileri ve aktivatörleri olan transkripsiyon 1 (STAT1) ve interferon düzenleyici faktör 1'in (IRF1) aktivasyon seviyelerini artırarak PDL1 transaktivasyonunu destekleyebileceğini ortaya koymuştur. Ancak, CRISPR/Cas9 aracılığıyla UBR5 ve PD-L1 ekspresyonunun kombine olarak ortadan kaldırılması, tek başına uygulanan blokajlardan daha sinerjik bir terapötik etkiye sahip olup, tümör mikroortamı üzerinde derin etkiler yaratmaktadır (Wu ve ark., 2022). Bu nedenle, CRISPR/Cas9, UBR5 fonksiyonunu inhibe ederek TNBC metastazını ve tümör büyümesini baskılamak için önemli bir araç olabilir.
ROR1, kanser ve embriyonik gelişim sırasında ifade edilen ve onkofetal bir protein olarak tanımlanan bir tip I transmembran proteinidir (Nicholas Borcherding, 2014). Çeşitli insan kanserlerinin invaziv davranışı, ROR1'in yukarı regülasyonu ile ilişkilidir. ROR1'i hedefleyen terapötik bileşikler içeren in vivo ve in vitro çalışmalardan umut verici sonuçlar elde edilmiştir (Chien vd., 2016). Meme dokusu biyopsilerinde yüksek ROR1 mRNA seviyeleri, agresif bazal benzeri meme (BL) tümörleri ve bunların vücudun diğer bölgelerine göçü ile de ilişkilendirilmiştir. Dahası, ROR1'in aşırı ekspresyonu, TNBC gelişimi için prognostik bir belirteç olarak tanımlanmıştır (Chien vd., 2016). Bununla birlikte, TNBC büyümesini ve metastazını baskılamak için CRISPR/Cas9 kullanarak ROR1'i susturmak etkili bir strateji olacaktır.
Siyalilasyon süreci, glikokonjugatlara siyalik asit eklenmesini içerir ve bu işlem siyaliltransferazlar (ST'ler) tarafından katalize edilir. ST8SIA1, ST ailesine aittir ve lenfositik lösemi ve kolorektal kanser gibi çeşitli hastalıkların patogenezinde önemli bir rol oynar (Chang vd., 2018). RNA sekans analizi, ST8SIA1'in TNBC hastalarının meme dokusunda yüksek oranda ifade edildiğini ve tümör baskılayıcı gen p53'teki mutasyonlarla pozitif korelasyon gösterdiğini, bunun da TNBC'nin patogenezine katkıda bulunabileceğini göstermektedir (Battula vd., 2017). Ayrıca, ST8SIA1, TNBC'nin metastazında ve tekrarlamasında rol oynar ve bu da TNBC'nin oluşumunda ve gelişiminde önemli bir rol oynadığını düşündürmektedir. TNBC'nin in vitro bir modelinde, CRISPR/Cas9 ile ST8SIA1'in baskılanmasının büyüme ve metastazı engellediği gösterilmiştir (Battula ve ark., 2017). Bu, CRISPR/Cas9'un TNBC tedavisinde ST8SIA1 onkogeninin işlevini engellemek için önemli bir araç olabileceğini düşündürmektedir.
NAT1, faz II ksenobiyotik bileşiklerin oluşumunu katalize eden ve neredeyse tüm insan dokularında ifade edilen metabolik bir enzimdir. NAT1, aromatik amin substratı yokluğunda bile asetil-CoA'yı (asetil-CoA) hedeflemek için kofaktör folatı kullanabilir (Stepp vd., 2015; Laurieri vd., 2014). Çalışmalar, NAT1'in meme kanseri hücre modellerinde matriks metalloproteinaz 9 (MMP9) fonksiyonunu düzenlediğini ve glikoz açlığı sırasında reaktif oksijen türlerine (ROS) karşı koruma sağladığını göstermiştir (Wang vd., 2018). NAT1'in silinmesinin piruvat dehidrojenaz kompleksini inhibe ederek mitokondriyal disfonksiyona yol açtığı gösterilmiştir (Wang L. vd., 2019). Ayrıca, çeşitli diğer raporlar, küçük moleküller ve siRNA susturma yöntemleri kullanılarak NAT1 inhibisyonunun meme kanseri hücrelerinin invazivliğini ve proliferasyonunu azaltabileceğini göstermiştir (Stepp vd., 2018). Son zamanlarda, CRISPR/Cas9, MDA-MB-231 meme kanseri hücre hattında NAT1'i baskılamak için kullanılmış ve ekspresyon seviyesine bağlı olarak hücresel metabolizmayı etkilemiştir. Bu çalışma ayrıca NAT-1'in TNBC'nin ilerlemesi ve metastazı için kritik olduğunu göstermiştir (Carlisle vd., 2020).
Onkogenlerin koordineli transkripsiyonu, süper güçlendiriciler, transkripsiyon faktörleri ve yardımcı faktörler tarafından düzenlenir (Hnisz vd., 2015). Ek olarak, CDK7, CDK8, CDK9, CDK12 ve CDK13 gibi bir grup siklin bağımlı kinaz (CDK), transkripsiyonel düzenleme için gereklidir. Bunlar arasında CDK7, TNBC patogenezinde onkogen transkripsiyonunun başlatılması ve genişletilmesi için çok önemli olan RNA polimeraz II'nin fosforilasyonunda rol oynar. Önemli bir çalışmada, CRISPR/Cas9 ile CDK7'nin silinmesi TNBC'yi inhibe etmiş ve bu da TNBC patogenezinin CDK7'ye bağlı olduğunu göstermiştir (Wang Y. vd., 2015).
Çalışmalar, MYC ve RBP'deki (RNA bağlayıcı protein) mutasyonların apoptoza yol açabileceğini, ancak MYC veya RBP'deki tek gen mutasyonlarının kanser hücrelerinin büyümesini etkilemediğini göstermiştir (Einstein vd., 2021). İnsan genomunda 1000'den fazla RBP, CRISPR/Cas9 tabanlı bir kütüphane kullanılarak taranmıştır. Bunlar arasında, 57 RBP'nin yüksek MYC seviyelerine sahip kanser hücrelerinin büyümesi için kritik olduğu bulunmuştur (Wheeler vd., 2020). Ek olarak, YTHDF2, TNBC hücre büyümesinin sürdürülmesinde önemlidir ve yüksek MYC ekspresyonuna sahip kanser hücrelerinde yüksek seviyeli transkripsiyon ve translasyon sırasında metillenmiş transkript miktarını azaltır. Ayrıca, YTHDF2, TNBC hastalarının hayatta kalma süresini uzatmak için yüksek MYC seviyelerine daha az bağımlı olan kanser hücreleri için gerekli değildir (Einstein vd., 2021), bu da TNBC'yi yenebilecek ilaçlar için potansiyel bir terapötik hedef olabileceğini düşündürmektedir.
Çinko parmak proteinleri (ZNF'ler), insan genomunun yaklaşık %1'ini oluşturur. Çalışmalar, ZNF'nin karaciğer kanseri, meme kanseri ve kolorektal kanser gibi çeşitli kanserlerde hücre çoğalmasını düzenleyebildiğini göstermiştir (Zhang W. vd., 2021; Li vd., 2017). CRISPR gen susturma yöntemiyle oluşturulan kütüphaneler, meme kanseri hücrelerinde çeşitli tümör baskılayıcı genleri (TSG'ler) taramak için kullanılmıştır (Shalem vd., 2014). O zamandan beri, CRISPR/Cas9 ZNF319 silinmiş meme kanseri hücrelerinin transkriptomik bir çalışması, ZNF319'un meme kanseri çoğalmasını azaltan ve bu nedenle çeşitli potansiyel sinyal mekanizmalarında ve diğer biyolojik fonksiyonlarda rol oynayan bir tümör baskılayıcı gen olduğunu göstermiştir (Wang L. vd., 2022).
Ferroptoz, demir varlığına bağlı bir tür programlanmış hücre ölümüdür. Ferroptoz gelişiminin lipid peroksitlerin varlığından etkilendiği bilinmektedir. Ek olarak, PKCβII'nin erken lipid peroksidasyonu sergilediği ve artan lipid peroksidasyonunun ferroptoz ile ilişkili olduğu bildirilmiştir. CRISPR/Cas9 aracılı kinaz inhibitörlerinin bir kütüphanesinin taranması, PKCβII'nin MDA-MB-231 hücrelerinde ferroptoz için kritik olan lipid peroksidasyon sürecinde yer aldığını ortaya koymuştur (Zhang vd., 2022). Bu nedenle, CRISPR/Cas9 ile PKCβII'nin devre dışı bırakılmasının, ferroptozla ilişkili hastalıkların tedavisi için potansiyel bir tümör baskılayıcı gen hedefi olabileceğini düşündürmektedir (Zhang vd., 2022).
İlaç direncinin kanser hastalarındaki ölümlerin yaklaşık %90'ından sorumlu olduğuna inanılmaktadır ve kanser tedavisindeki en büyük zorluklardan biridir (Bukowski vd., 2020). Sonuçlar, ilaç atılımı, DNA onarımı, apoptoz ve çeşitli hücre sinyal yollarıyla ilgili yeterli sayıda genin ilaç direnciyle ilişkili olduğunu göstermektedir (Haider vd., 2020). Bunlar arasında, CRISPR/Cas9 araçlarıyla hedeflenen ve ilaç direncini azaltmada ve kanser karşıtı tedavilerin etkinliğini artırmada umut verici sonuçlar gösteren çeşitli genler bulunmaktadır (Vaghari-Tabari vd., 2022). Ek olarak, yüksek verimli CRISPR/Cas9 gen nakavt tarama kütüphanelerinin, potansiyel ilaç direnci gen hedeflerinin işlevini değiştirmede rol oynadığı belirtilmiştir (Shalem vd., 2015). Paklitaksel direnç genlerini belirlemek için, genom çapında sgRNA kütüphanesi taramasıyla birleştirilmiş RNA dizileme yöntemi kullanılarak, tekrarlayan TNBC hastalarında ilaç direncine bağlı olan histon deasetilaz 9 (HDAC9) dahil olmak üzere sekiz aday gen tanımlanmıştır (B vd., 2020). Başka bir çalışmada, antikanser ilaçlarla tedavi edilen TNBC hastalarının hayatta kalma süresi boyunca diserin/treonin ve tirozin protein kinaz (DSTYK) ekspresyonunda artış gözlemlenmiştir. Dahası, CRISPR/Cas9 aracılığıyla DSTYK'nin susturulması, ilaç dirençli kanser hücrelerinin (SUM102PT hücreleri ve MDA-MB-468 hücreleri) ve in vivo bir TNBC modelinin apoptozunu önemli ölçüde artırmıştır (Ogbu vd., 2021).
TNBC'de MAPK yolunun anormal aktivasyonu olmasına rağmen, MEK hedefli tedavilerin klinik etkisi zayıftır. Bir CRISPR/Cas9 genomik kütüphane taraması, PSMG2'nin (proteom montaj şaperonu 2) inhibisyonunun TNBC BT549 ve MB468 hücrelerini MEK inhibitörü AZD6244'e duyarlı hale getirdiğini ortaya koymuştur. PSMG2'nin CRISPR/Cas9 ile susturulması, normal proteazom fonksiyonunu değiştirerek, PDPK1'in otofaji aracılı parçalanmasına yol açmış ve böylece AZD6244 (MEK inhibitörü) ve MG132 (proteazom inhibitörü) ile indüklenen TNBC fare modellerindeki tümör hücrelerini daha da iyileştirmiştir. Bu nedenle, proteazom ve MAP kinaz (MEK) inhibitörleri, tümör hücresi proliferasyonunu azaltmak için sinerjik olarak uygulanabilir (Wang X. vd., 2022).
CRISPR/Cas9, TNBC direncine yol açan gen fonksiyon kaybını taramak için de kullanılmıştır (Shu vd., 2020). Ge vd., TNBC'de BET bromodomain inhibitörü (BBDI) olan JQ1 ile tedavi edilen kanser hücrelerinin ilaç direnci mekanizmasını açıklamıştır. CRISPR/Cas9 kullanarak, rb1 geninin silinmesinin TNBC'nin anti-kanser ilacı JQ1'e dirençli hale gelmesine neden olduğunu bulmuşlardır. Bu nedenle, rb1 fonksiyonu, TNBC'de JQ1 ilaçlarına verilen yanıtta önemlidir. Ayrıca, paklitakselin bir CDK4/6 kinaz/mikrotübül inhibitörü olduğunu ve JQ1 gibi BBDI'lerle kombinasyonunun, ilaca dirençli TNBC'ye umut verici terapötik yanıtlar sağlayabileceğini bildirmişlerdir (Ge vd., 2020).
Uzun kodlayıcı olmayan RNA'ların (lncRNA) transkripsiyonel yapısının, TNBC'de neoadjuvant tedaviye dirençten sorumlu olduğu bildirilmiştir. Bu çalışma, beş farklı MALAT1 lncRNA transkriptinin TNBC'de yüksek düzeyde ifade edildiğini göstermektedir. Ek olarak, CRISPR/Cas9 aracılığıyla MALAT1'in silinmesi, TNBC BT-549 hücrelerinin paklitaksel ve doksorubisine duyarlılığını artırmış ve bu da MALAT1 direncinin TNBC'de potansiyel bir rolüne işaret etmiştir (Shaath ve ark., 2021).
BRCA1 (BRCA1m) genindeki mutasyonlar heterojendir ve bu nedenle tespit edilmesi zordur. BRCA1'in sentetik ölümcül ortağı olan PARP1'i (poli(ADP-riboz) polimeraz) hedeflemek, TNBC ilaç kemoterapi duyarlılığını artırabilir. CRISPR/Cas9 kullanılarak, PARP1'in silinmesi, doxorubicin, gemcitabine ve docetaxel gibi antikanser ilaçların mBRCA1 mutant TNBC hücrelerine duyarlılığını artırmıştır; bu da PARP1'in TNBC'de ilaç direncinde de rol oynadığını düşündürmektedir (Vaghari-Tabari vd., 2022). Tümör baskılayıcı genler BRCA1 veya BRCA2'deki mutasyonların, insanlarda meme kanseri gelişme olasılığını artırdığı bilinmektedir. Bu hastaların tedavisi, PARP inhibitörlerinin kullanımını gerektirir. Ek olarak, CRISPR/Cas9 kullanılarak nükleotid kurtarma faktörü DNPH1'in devre dışı bırakılmasının, toksik nükleotid 5-hidroksimetildeoksiüridin (hmdU) monofosfatı ortadan kaldırabileceği ve böylece BRCA eksikliği olan hücrelerin PARP inhibitörlerine duyarlılığını artırabileceği gösterilmiştir (Fugger vd., 2021). Bu nedenle, CRISPR/Cas9 ve PARP1 inhibitörleri, TNBC için önemli bir tedavi stratejisi haline gelebilir.
Penetran glikoprotein (P-gp) geni, tüm TNBC'lerin yaklaşık %41'inde genel olarak yukarı regüle edilen çoklu ilaç direnci genidir (Sun vd., 2020). P-gp kaynaklı ilaç atılımı, meme kanserinde ilaç direncinin temel bir düzenleyicisi olarak tanımlanmıştır. P-gp inhibitörlerinin meme kanserinde antikanser ilaçlara karşı duyarlılığı artırdığı gösterilmiştir (Famta vd., 2021). Bu nedenle, CRISPR/Cas9 aracılığıyla P-gp'nin ortadan kaldırılması veya baskılanması ve P-gp inhibitörleri, TNBC'de ilaç direncini aşmak için çok önemli yöntemler olabilir.
ATP bağlayıcı kaset taşıyıcı G2 (ABCG2), TNBC'de ilaç direncine neden olduğu bilinmektedir (Palasuberniam vd., 2015), ancak şu anda CRISPR/Cas9 ile ABCG2 susturulması ve tümör baskılayıcı gen inaktivasyonu arasındaki ilişkiye dair herhangi bir rapor bulunmamaktadır. PTEN, ABCG2 aktivasyonunu artırabilir (Palasuberniam vd., 2015), (Deepak Singh vd., 2021). Bu nedenle, ABCG2'yi ortadan kaldırmak için CRISPR/Cas9 kullanmak ve bunu bir ABCG2 inhibitörü ile birleştirmek, TNBC'deki ilaç direncini aşmak için uygun bir tedavi olabilir. Tablo 2, tüm direnç genlerini hedefleyen CRISPR/Cas9'u belirtmektedir.
Tablo 2. CRISPR/Cas9, hücreleri antikanser ilaçlara duyarlı hale getirmek için çeşitli TNBC direnç genlerini hedef alır.
CRISPR/Cas9 kütüphaneleri, kanser patogeneziyle ilişkili gen mutasyonlarını taramak için potansiyel araçlardır (Chan vd., 2022). Bu tarama yöntemi, (a) kütüphane oluşturma, (b) lentiviral transdüksiyon, (c) fenotipik tarama ve (d) hedef gen analizi gibi dört adımdan oluşmaktadır. TNBC'de MAPK yolunun anormal aktivasyonu olmasına rağmen, PTEN, RB1 ve TP53 gibi tümör baskılayıcı genlerde mutasyon taşıyan TNBC hastaları için MEK hedefli tedavinin klinik prognozu çok kötüdür.
Ek olarak, Guatemala çiçek ve yaprak özlerinde bol miktarda bulunan en güçlü ve seçici molekül olan dehidrokatrolün MDA-MB-231 üzerindeki etkisini anlamak için CRISPR/Cas9 kullanılarak bir gen nakavt taraması yapıldı. Seçici hücre sitotoksisitesinin mekanizmaları. TNBC alt tiplerinin mezenkimal kök hücre özellikleri. Bu CRISPR/Cas9 tabanlı tarama ayrıca, 17β-hidroksisteroid dehidrojenaz tip 11'i kodlayan bir gen olan HSD17B11'in MDA-MB-231 hücrelerinde yüksek oranda ifade edildiğini ve MDA-MB-231 hücrelerine özgü dehidrofalkarinol ile sonuçlandığını ortaya koydu (Grant vd., 2020). Bu nedenle, CRISPR/Cas9 genomik taramasının, potansiyel doğal bileşiklerin antikanser özelliklerinin altında yatan mekanizmaları belirlemede büyük bir potansiyele sahip olduğunu göstermektedir.
Ek olarak, TNBC'nin kansere karşı duyarlılığı, tarafsız bir genom çapında in vivo CRISPR/Cas9 taraması kullanılarak incelenmiş ve onkojenik ve tümör baskılayıcı yollar arasında bir bağlantı gösterilmiştir. mTOR ve Hippo yollarının temel bileşenlerinin TNBC'de tümör düzenlemesinde önemli roller oynadığı bildirilmiştir. Ayrıca, çalışmalar, mTORC1/2 ve YAP onkoproteininin farmakolojik inhibisyonunun, in vitro ilaç-matris sinerji modeli ve in vivo hasta kaynaklı ksenogreftler kullanılarak TNBC'nin patojenitesini etkili bir şekilde inhibe ettiğini göstermiştir. Dahası, Torin-1 aracılı mTORC1/2 inhibisyonu makropinositozu artırırken, verteporfin kaynaklı YAP inhibisyonu TNBC hücre ölümüne yol açmaktadır. Sonuç olarak, bu bulgular, TNBC için yeni ve etkili tedaviler belirlemede genom çapında in vivo CRISPR taramasının gücünü ve sağlamlığını vurgulamaktadır (Dai vd., 2021).
Bağışıklık sisteminin düzensizliği, tümör oluşumunda önemli bir faktördür. Kanser hücreleri, tümör mikroortamındaki bağışıklık hücrelerinin aktivitesine müdahale ederek ve bağışıklık sistemini tehlikeye atarak savunma mekanizmalarını atlatarak bağışıklık sisteminden kurtulmayı başarır. Bu nedenle, geliştirilmiş bir bağışıklık sistemi, tümörlerle mücadelede kilit bir yaklaşım olabilir. CRISPR/Cas9 tabanlı gen modifikasyonu, bağışıklık sistemi disfonksiyonuyla ilgili çeşitli sorunları farklı açılardan ele almaktadır. CRISPR/Cas9, aşağıdaki yollarla meme kanserine karşı antitümör bağışıklığını iyileştirmek için kullanılmıştır (Şekil 3).
Şekil 3. CRISPR/Cas9 immünoterapisi TNBC hücrelerini hedef alır. CDK5 kaybı ve PDL1 ile CD155'in baskılanması bağışıklık sistemini güçlendirir. Benzer şekilde, A2AR kaybı ve HER2, müsin 1 ve TEM8 gibi TAA'ların baskılanması, CAR-T hücrelerinin kanser hücrelerini öldürme verimliliğini artırmıştır. CRISPR/Cas9 güdümlü T hücresi taraması, p38 kinazın bozulmasının T hücresi antitümör aktivitesini artırdığını göstermiştir. CRISPR/Cas9 ile modifiye edilen T hücreleri, TCR (T hücresi reseptörü) ifadesini artırarak T hücrelerinin antitümör aktiviteye sahip olmasını sağlar.
İmmünoterapinin amacı, bağışıklık sistemini kanser hücrelerine saldırması için uyarmaktır. Bağışıklık kontrol noktası proteinlerinin aşırı ekspresyonu genellikle otoimmün reaksiyonları önler, ancak kanserlerin bunlardan kaçınmasına yardımcı olabilir (Topalian vd., 2015). Bu proteinler, bağışıklık hücrelerinin yüzeyindeki reseptörlere bağlanarak bağışıklık reaksiyonlarını önler. Birden fazla kontrol noktası proteini (CD155 ve PD-L1 gibi) bağışıklık hücrelerindeki PD-1 reseptörünü hedef alır ve özellikle TNBC'de olmak üzere meme kanserinde eksprese edilir (Li Y.-C. vd., 2020). CRISPR/Cas9 kullanılarak PD-L1 veya reseptörünün baskılanması, bağışıklık sistemini TNBC tümörlerine saldırması için uyarabilir (Yahata vd., 2019). Ek olarak, CRISPR/Cas9 aracılığıyla CDK5'in silinmesi yoluyla PD-L1 ekspresyonunun aşağı regülasyonunun, in vitro ve in vivo olarak tümör büyümesini inhibe ettiği gösterilmiştir (Deng vd., 2020). Meme kanserinin in vitro ve in vivo modellerinde büyüme inhibisyonu, shRNA aracılığıyla CD155'in azaltılmasının meme kanseri üzerinde terapötik bir etkiye sahip olabileceğini düşündürmektedir (Gao ve ark., 2018).
CAR T hücreleri, tümörle ilişkili antijenleri (TAA'lar) tanıyan CAR'ları ifade eder ve aktivitelerini artırmak için kontrol noktası proteinlerinin baskılanmasını kullanabilir (Li C. vd., 2020). Meme kanserinde CAR T hücresi tedavisi için çeşitli potansiyel hedefler vardır; bunlar arasında HER2, mucin1 ve TEM8 gibi çeşitli TAA'lar bulunur (Bajgain vd., 2018). PD-1'in CRISPR/Cas9 kullanılarak baskılanması durumunda, mezotelini (TNBC BT-459 hücrelerinde aşırı ifade edilen) hedefleyen CAR T hücrelerinin kansere karşı daha etkili olduğuna dair kanıtlar vardır (Hu vd., 2019). Bununla birlikte, hastalardan T hücrelerini izole etmek ve daha sonra bunları ex vivo olarak düzenlemek, emek yoğun ve zaman alıcı bir süreçtir. Evrensel T hücreleri izolasyon gereksinimlerini azaltabilse de, greft-konakçı anormalliklerini önlemek için insan lökosit antijeni (HLA) sınıf I ve T hücre reseptörü (TCR) eksprese eden donör T hücreleri çıkarılmalıdır (Ren vd., 2017, 2017a). CRISPR/Cas9 kullanılarak, HDR, TCR ve HLA'yı eş zamanlı olarak ortadan kaldırabilir ve CAR'ı kodlayan geni devre dışı bırakabilir. Çalışmalar, CRISPR/Cas9'un anti-CD19 CAR'ları TCR lokusuna yerleştirmek için kullanılabileceğini ve böylece T hücrelerini tüketmeden verimli bir şekilde CAR üretilebileceğini göstermiştir (Dimitri vd., 2022). TCR, beta-2-mikroglobulin (B2M), HLA-I alt birimi ve PD-1 ve CTLA-4 gibi daha büyük anti-kanser özelliklerine sahip olabilecek diğer proteinleri eş zamanlı olarak ortadan kaldırarak allojenik CAR T hücreleri üretmek için çoklu teknolojiler geliştirilmiştir. TNBC'ye karşı (Eyquem ve diğerleri, 2017; Liu ve diğerleri, 2017; Ren ve diğerleri, 2017b; Dimitri ve diğerleri, 2022).
CRISPR/Cas9 kullanımı, CAR-T hücrelerinin etkinliğini artırabilir. Adenozinin immünosupresif özelliklere sahip olduğu ve T hücre fonksiyonunu bloke ederek ve adenozin A2A reseptörlerini (A2AR) aktive ederek antikanser bağışıklığını azaltabileceği bilinmektedir (Vigano vd., 2019). CRISPR/Cas9 kullanılarak A2AR'nin susturulması, in vivo olarak CAR-T hücrelerinin etkinliğini önemli ölçüde artırmıştır (Giuffrida vd., 2021). T hücrelerinin hücresel genişleme, farklılaşma, oksidatif stres ve genomik stres gibi çeşitli fenotipik özellikler sergilediği bilinmektedir. CRISPR/Cas9 tabanlı T hücre taraması, 25 farklı T hücre reseptör kinazının bozulmasını ortaya koymuştur. Bunlar arasında, p38 kinazının silinmesinin T hücrelerinin antitümör aktivitesini artırdığı gösterilmiştir; bu da p38 kinazının CAR-T hücresi düzenlemesinin önemli bir düzenleyicisi olduğunu göstermektedir (Gurusamy vd., 2020).
T hücreleri, yüksek düzeyde ifade edilen TCR'ler üretmek için CRISPR/Cas9 kullanılarak genetik olarak modifiye edilebilir. Genetik olarak modifiye edilmiş T hücrelerinin hastalara aktarılması, endojen T hücrelerine göre daha güçlü antikanser aktivite göstermiştir. Bu nedenle, endojen TCR'ler hastalarda genetik olarak değiştirilmiş TCR'lerle rekabet edebilir ve bu da kanser immünoterapisinin potansiyelini etkileyebilir. Bu sorunun üstesinden gelmek için, alıcı hücrelerdeki endojen TCR-β'yı ortadan kaldırmak için CRISPR/Cas9 kullanmak ve daha sonra TCR-β T hücrelerini kanser hastalarına aktarmak, endojen TCR cinsel rekabetine gerek kalmadan daha iyi antikanser bağışıklık yanıtları gösterebilir (Fan vd. 2018). Bu nedenle, CRISPR ile modifiye edilmiş T hücreleri hariç, TCR'ler normal TCR transdüksiyonlu T hücrelerine göre tümör antijenlerine bin kat daha duyarlıdır. Ek olarak, çeşitli lösemilerde, γδ TCR+ CRISPR ile oluşturulan değiştirilmiş T hücreleri, standart TCR transferine kıyasla daha yüksek CD4+ ve CD8+ T hücresi ekspresyonu sergilemektedir (Legut ve ark., 2018). Bu nedenle, CRISPR/Cas9 ile oluşturulan modifiye T hücreleri, TNBC'nin üstesinden gelmek için etkili bir immünoterapi yöntemi olabilir.
İntegrinler, hücre zarlarında bulunan ve hücrelerin hücre dışı matrise (ECM) bağlanmasını sağlayan hücre yapışma molekülleridir (Hamidi ve Ivaska, 2018). İntegrinlerin düzensizliği, hücre dışı matrisi değiştirerek kanser gelişimi ve göçüyle ilişkilidir ve kanser hücrelerinin dolaşımda hayatta kalmasına yol açar (Hamidi ve Ivaska, 2018). CRISPR/Cas9 aracılı integrin baskılanması, TNBC'de tümör ilerlemesini, metastazı ve kolonizasyonu yavaşlatır. İntegrin a5'in (ITGA5) baskılanmasının, akciğer kanseri gibi diğer kanserlerde hücre göçünü ve ilerlemesini azalttığı bildirilmiştir (Ju vd., 2017), bu da integrin a5'in TNBC patogenezinde de önemli bir faktör olabileceğini düşündürmektedir.
Geleneksel embriyonik kök hücre (ES) yöntemleri kullanılarak gen nakavt farelerin üretilmesi, emek yoğun, zaman alıcı ve verimsiz bir süreçtir. Homolog rekombinasyon yoluyla ES hücrelerini hedeflemek, kimerik fareler üretmek ve ardından homozigot yavrular üretmek için heterozigot farelerle çaprazlamak aylar ve yıllar sürer. Birden fazla genetik mutasyona sahip fareler oluşturmak için karmaşık çaprazlama gereklidir. Bununla birlikte, CRISPR/Cas9 kullanılarak ES hücrelerinin ablasyonu veya CRISPR/Cas9 bileşenlerinin tek hücreli döllenmiş yumurtalara mikroenjeksiyonu yoluyla üretilen fareler kullanıldığında birçok sorun ortaya çıkmıştır. Örneğin, değişikliklerin eklenmesi genellikle biallelik lokuslarda meydana gelir ve gene özgü değildir. Son zamanlarda, CRISPR/Cas9 teknolojisini kullanan ES hücrelerinin aynı anda 5 gene kadar biallelik mutasyon ekleyebildiği bildirilmiştir (Nishizono vd., 2021). Bu amaçla, Cas9 mRNA ve beş gene özgü gRNA aynı anda ES hücrelerine transfect edilmiştir. Bu, bu prosedürün vaadini ve etkinliğini vurgulamaktadır, ancak bu mutasyonlar, kurucu soylar beşli gen nakavt fareleri üretmek için çiftleştirildiğinde aktarılmış olabilir. Çalışma ayrıca şaşırtıcı bir keşfi de rapor etmektedir: Genetiği değiştirilmiş fareler oluşturmak için artık ES hücrelerine gerek yoktur. Bunun yerine, belirli gen ürünlerini çıkarmak için Cas9 mRNA ve gRNA, tek hücreli embriyolara enjekte edilmiştir. Sonuç olarak, teorik olarak farelerde gen silinmesinin sonuçlarını incelemek için kullanılabilecek gen nakavt kurucu soyları oluşturulmuştur (Qin vd., 2016). Böylece, CRISPR/Cas9, geleneksel genetik mühendisliğine göre daha düşük maliyetle TNBC'yi tedavi etmek için transgenik farelerin oluşturulmasına olanak tanır. CRISPR/Cas sistemi kullanılarak, TNBC'de bir veya daha fazla endojen gende nokta mutasyonlarını başarıyla ortaya çıkarabilen yeni bir gen nakavt fare modeli geliştirilmiştir. Bu konsepte dayanarak, BRCA1 ve p53'ün CRISPR/Cas9 aracılığıyla silinmesiyle TNBC'nin hayvan modelleri de geliştirilebilir; bu da HR onarımının kaybına, genomik istikrarsızlığa ve mutant fenotiplere yol açar (Annunziato ve ark., 2020).
Şu anda, TNBC'yi teşhis etmek için mamografi, manyetik rezonans görüntüleme (MRG) ve ultrason gibi çeşitli yöntemler kullanılmaktadır. Ancak bu yöntemlerin bazı sınırlamaları vardır. Mamografi, kanser hücrelerinin diğer organlara göç ettiği metastazlardan ziyade lokal meme dokusunu teşhis etmek için kullanılır. Ultrasonografi, TNBC'yi teşhis etmek için güvenilir bir yöntem değildir (Chen ve Lee-Felker, 2023). MRG, ultrason ve mamografiden daha yüksek hassasiyete sahiptir, ancak tanısal doğruluğu sınırlıdır (Sha ve Chen, 2022). Doku biyopsisi, kanser hücrelerini belirlemek için invaziv bir yöntemdir. Bununla birlikte, bazı durumlarda, iğne ilgi alanından uzaklaşırsa biyopsi kanserli dokuyu atlayabilir. Ayrıca, çok pahalıdır ve hasta için travmatik olabilir. TNBC heterojen bir kanser türüdür, bu nedenle biyopsi kanser türü hakkında yeterli bilgi sağlamayabilir. Bu nedenle, TNBC'yi tespit etmek için yeni ve tanısal olarak güvenilir bir yönteme acilen ihtiyaç duyulmaktadır. CRISPR/Cas9, meme kanseri tanısı için oldukça hassas ve minimal invaziv bir alternatif olarak hizmet edebilir. Bu amaçla, CRISPR/Cas9 tabanlı stratejiler, TNBC tanısı için PCR yöntemlerini geliştirmek için kullanılabilir. İlk olarak, CRISPR sisteminin Cas9 ve cpf1 proteinleri, spesifik olmayan DNA'yı uzaklaştırmak için kullanılır ve daha sonra bu iki protein (Cas9 ve cpf1), hedef DNA'ya bağlanmadan önce PAM dizisini tanıyabilir (Deepak Singh vd., 2021). Böylece, PCR, kanser gelişimiyle ilişkili mutasyonları tanımlayabilir. Birçok çalışma, farklı kanserlerde farklı mutasyonları tespit etmek için bu CRISPR tabanlı stratejiyi benimsemiştir (Safari vd., 2019). Bu nedenle, CRISPR tabanlı PCR yöntemleri, TNBC tanısının biyopsi tabanlı immünohistokimya gibi invaziv yöntemlere olan bağımlılığını azaltabilir.
TNBC'de hormon reseptörü düzenlemesinde genotipik değişiklikler de gösterilmiştir (Chen ve Russo, 2009). Mikroarray kullanan CRISPR/Cas9 tabanlı PCR stratejileri, bu mutasyonları etkili bir şekilde izleyebilir (Hajian vd., 2019). Ayrıca, sağlık çalışanlarına TNBC hastalarındaki spesifik mutasyonlar hakkında ilgili bilgiler sağlayarak tedavi süreçlerinin iyileştirilmesine yardımcı olabilir. Bununla birlikte, bu kombine tekniğin sınırlamaları vardır. Bu nedenle, bu CRISPR/Cas-PCR yönteminin TNBC tanısı için sağlık hizmetlerinde kullanılabilmesi için kapsamlı araştırma çalışmaları gerekmektedir (Yang vd., 2019).
Yayın tarihi: 14 Ekim 2024